梅毒螺旋體體內(nèi)誘生抗原Tp0462的表達鑒定及在臨床血清學診斷中的應(yīng)用評價

劉文 鄧美霞 張曉紅 趙鐵 羅茜 趙飛駿 尹衛(wèi)國

421001湖南衡陽，南華大學病原生物研究所 特殊病原體防控湖南省重點實驗室（劉文、鄧美霞、張曉紅、趙鐵、羅茜、趙飛駿）；汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院檢驗科（尹衛(wèi)國）

梅毒的診斷目前主要依靠血清學診斷［1］。以梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）外膜蛋白和鞭毛蛋白為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法因其客觀、準確、耗時短，易于自動化和數(shù)字化等優(yōu)勢［2］，在梅毒血清學診斷中得到了一定的應(yīng)用。代表性的診斷抗原包括 TPN15（Tp1071）、TPN17（Tp0435）、TPN47（Tp0574）、TPN44.5（TmpA，Tp0768）和Tp0663等膜脂蛋白［3-4］，以及鞭毛蛋白 FlaB1、FlaB2 和FlaB3［5］。目前特異性血清學方法尚不能用于評價梅毒的療效［1］。臨床以非Tp為基礎(chǔ)的血清學試驗，如快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR）和甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）等，主要用于梅毒的判愈實驗，但假陽性率較高。本課題組在前期動物實驗篩選Tp體內(nèi)誘生抗原過程中，發(fā)現(xiàn)Tp0462可能具有體內(nèi)誘生抗原的特點，并與Tp感染新西蘭兔血清和臨床梅毒患者血清標本有較好的反應(yīng)性。因此，在本研究中，我們構(gòu)建重組蛋白Tp0462，鑒定其是否為體內(nèi)誘生抗原，同時建立間接ELISA法，以臨床患者血清標本進行Tp0462血清學診斷的評價，為尋求新的梅毒血清學診斷方法奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

1.實驗動物：新西蘭兔（SYXK湘2010-0006）由南華大學醫(yī)學科學研究中心實驗動物部提供并飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫18～20℃，飼料和飲用水無抗生素。

2.菌株和質(zhì)粒：Tp Nichols標準株由上海市皮膚病性病醫(yī)院檢驗科顧偉鳴主任和廈門大學中山醫(yī)院檢驗科楊天賜主任惠贈，并由南華大學醫(yī)學院病原生物研究所成功傳代保存。E.coli Rosetta（DE3）株、重組質(zhì)粒pET43.1a（+）/Tp92由本研究所成功構(gòu)建并保存。

3.主要試劑：Qiagen基因組提取試劑盒（德國Qiagen公司），Toxin EraserTM內(nèi)毒素去除試劑盒（美國GenScript公司），二喹啉甲酸（BCA）微量蛋白試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Ninety sixwell ELISA plates（美國Costar公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗人/兔IgG二抗（美國Invitrogen公司），梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA，日本富士瑞必歐株式會社）、梅毒初篩ELISA試劑盒（珠海麗珠試劑股份有限公司），RPR檢測試劑盒（上?？迫A生物工程股份有限公司）。

4.標本來源：336份血清標本來自于廣東省粵北市人民醫(yī)院和清遠市人民醫(yī)院2014年9月至2015年9月的336例住院患者，男122例（36.3%），年齡0～92歲（中位數(shù)為51.5歲）；女214例（63.7%），年齡0～80歲（中位數(shù)為34.5歲）。其中梅毒血清檢測陽性168例，由臨床醫(yī)生根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及性接觸史確診為梅毒，包含一期梅毒36例，二期梅毒41例，三期梅毒12例，胎傳梅毒4例，隱性梅毒75例。梅毒血清檢測陰性168例，包括孕婦49例，體檢51例，鉤體病5例，EBV感染25例，風濕病28例，傷寒10例。受檢者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)過廣東省粵北市人民醫(yī)院和清遠市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

二、方法

1.Tp Nichols株全基因組的提?。焊鶕?jù)Qiagen基因組提取試劑盒說明書操作流程提取Tp全基因組DNA模板。

2.Tp0462重組蛋白的克隆表達、純化及鑒定：從 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nhi.gov/）中 獲 取Tp0462的基因序列，利用Primer 6.0軟件，結(jié)合pET30a（+）酶切位點圖譜設(shè)計引物，引入酶切位點和保護性堿基分別如下，P1：5′CGCGGATCCGTGCG CCGCATAGTCTGT3′（BamHI）；P2：5′CCGCTCGAG TCAGTGTTGCCCGTTTTTGA3′（XhoI）。以提取的Tp Nichols株DNA為模板，P1和P2為引物，PCR擴增Tp0462，克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a（+）-Tp0462，轉(zhuǎn)化至表達菌E.coli Rosetta（DE3），挑選陽性克隆在含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜，次日取培養(yǎng)物1∶100轉(zhuǎn)種至其吸光度（A600）=0.6，20℃條件下異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（終濃度為0.5 mmol/L）誘導培養(yǎng)4 h。離心收集菌體，超聲波破碎菌體后分別收集上清液和沉淀，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析表達結(jié)果。大量誘導表達重組蛋白，鎳-次氮基三乙酸（Ni-NTA）親和層析柱純化表達產(chǎn)物，Western印跡法鑒定重組蛋白的抗原特異性，BCA試劑盒測定蛋白濃度，純化蛋白用于后續(xù)ELISA實驗。

3.體內(nèi)誘生抗原Tp0462蛋白的鑒定：18只新西蘭兔按體重大小編號并用分層隨機法分為活Tp接種組、紫外線照射法滅活Tp接種組、未接種對照組，每組6只，接種途徑為睪丸接種。睪丸出現(xiàn)紅腫及TPPA和RPR試驗均陽性判定活Tp接種成功。接種后8周內(nèi)每隔1周兔耳緣靜脈抽血1 ml分離血清備用。將10 mg/L純化重組蛋白Tp0462包被ELISA板，3 mg/L外膜蛋白Tp92包被ELISA板作對照，5%脫脂牛奶4℃孵育過夜，含吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBS-T）洗板3次，每孔分別加入100 μl 1∶200稀釋的各組兔血清37℃孵育2 h。PBS-T洗滌5次，加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗（5%脫脂牛奶稀釋至1∶10 000）37℃反應(yīng)30 min。PBS-T洗滌5次后加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色，20 min后加終止液（2 mol/L H2SO4）。Multiskan MK3全自動酶標儀讀取A450值，每個樣本復測3次。

4.建立Tp0462-ELISA并與其他梅毒血清診斷試驗進行比較：以10 mg/LTp0462蛋白包被ELISA 96孔板，5%脫脂牛奶4℃封閉24 h，PBS-T洗板3次。336份血清樣本為一抗（1∶100，以5%脫脂牛奶稀釋），每孔100 μl，于37 ℃孵育1 h，PBS-T洗板5次。HRP標記的山羊抗人IgG抗體為二抗（1∶10000），每孔100 μl，37 ℃孵育30 min，PBS-T洗板5次。37℃TMB顯色20 min，加終止液，在全自動酶標檢測儀上讀取A450值。同時對這336份血清分別按照試劑盒操作說明書進行TPPA試驗、珠海麗珠梅毒初篩ELISA試驗和RPR檢測。所有樣本重復測定3次，取平均值。

5.統(tǒng)計學分析：采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。Tp0462體內(nèi)誘生抗原性質(zhì)鑒定實驗數(shù)據(jù)采用兩因素重復測量方差分析；Tp0462-ELISA與TPPA、麗珠梅毒初篩ELISA試劑盒及RPR試劑盒的診斷評價比較，采用診斷試驗的四格表法分析；Tp0462-ELISAA450值與RPR滴度的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、重組質(zhì)粒Tp0462-pET30a（+）在E.coli Rosetta（DE3）中的誘導表達和鑒定

重組質(zhì)粒Tp0462-pET30a（+）在E.coli Rosetta（DE3）的表達條件：當37℃增菌至細菌生長對數(shù)期時，重組蛋白Tp0462表達最佳條件為0.5 mmol/L IPTG，20℃，180 rpm搖床誘導培養(yǎng)4 h（圖1泳道5）。用封閉液稀釋血清為一抗，采用Western印跡法鑒定重組蛋白，Tp0462僅與梅毒陽性血清反應(yīng)，與陰性血清不反應(yīng)（圖2）。大量誘導表達后，將超聲裂解后的重組蛋白Tp0462的上清液經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，SDS-PAGE分析，采用不同濃度咪唑洗脫后，對應(yīng)在相對分子質(zhì)量37 000左右有1條明顯的單條帶且純度在85%以上。

二、Tp0462的體內(nèi)誘生抗原性質(zhì)鑒定

接種約第2周，活Tp接種組新西蘭兔睪丸出現(xiàn)明顯紅腫，且血清TPPA試驗及RPR試驗均為陽性，說明感染成功?；頣p接種組血清Tp0462特異性抗體水平從第2周起急劇上升，5周后趨于平穩(wěn)，而滅活Tp接種組及未接種對照組一直處于低水平且無升高趨勢（圖3A）。經(jīng)兩因素重復測量方差分析，不同組間Tp0462特異性抗體水平差異有統(tǒng)計學意義（F=3 574.9，P＜0.05），且隨時間有一定的變化（F=158.8，P＜0.05）。處理效應(yīng)和時間效應(yīng)的交互作用有統(tǒng)計學意義（F=159.9，P＜ 0.05），即不同處理組Tp0462特異性抗體水平隨時間變化的趨勢不同。組間兩兩比較顯示，活Tp接種組Tp0462特異性抗體水平高于滅活Tp接種組及未處理組（P＜0.05），而滅活Tp接種組與未處理組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.256）。

圖1 重組載體Tp0462表達的SDS-PAGE結(jié)果 M：蛋白Marker；1：E.coliBL21（DE3）/Tp0462；2：Rosetta（DE3）菌 ；3：pET30a/Rosetta（DE3）；4：pET30a（+）-Tp0462/Rosetta（DE3），20 ℃條件下0.5 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導上清液；5：pET30a（+）/Tp0462E.coli Rosetta（DE3），20℃條件下0.5 mmol/L IPTG誘導沉淀；6：pET30a（+）-Tp0462/Rosetta（DE3），37 ℃條件下0.5 mmol/L IPTG誘導上清液；7：pET30a（+）/Tp0462E.coli Rosetta（DE3），37 ℃條件下0.5 mmol/L IPTG誘導沉淀

圖2 重組蛋白Tp0462的純化鑒定 M：蛋白Marker；1：表達菌裂解液；2：流出液；3：20 mmol/L咪唑洗脫液；4、5：50 mmol/L咪唑洗脫液；6：100 mmol/L咪唑洗脫液；7、8：500 mmol/L咪唑洗脫液

圖3 不同接種組Tp0462蛋白和外膜蛋白Tp92特異性抗體吸光度（A450）隨時間的變化。n=6 3A：Tp0462特異性抗體水平變化，活Tp接種組高于滅活Tp接種組及未處理組（P＜0.05），而后兩組間無明顯差別；3B：Tp92特異性抗體水平變化，活Tp接種組與滅活Tp接種組無明顯差別，但這兩組均高于未處理組（P＜0.05）

活Tp接種組與滅活Tp接種組兔血清Tp92特異性抗體水平從第2周起均呈現(xiàn)上升趨勢，5周后趨于平穩(wěn)（圖3B）。重復測量方差分析顯示，不同處理組間Tp92特異性抗體水平差異有統(tǒng)計學意義（F=1 926.8，P＜0.05），且隨時間有顯著變化（F=102.5，P＜0.05）。處理效應(yīng)和時間效應(yīng)的交互作用有統(tǒng)計學意義（F=26.1，P＜0.05），即不同處理組Tp92特異性抗體水平隨時間變化的趨勢不同。組間兩兩比較顯示，活Tp接種組Tp92特異性抗體水平與滅活Tp接種組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.127），但2組均高于未處理組（P＜0.05）。

三、Tp0462-ELISA與TPPA試驗、梅毒初篩ELISA試驗及RPR試驗的比較

Tp0462-ELISA對一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和隱性梅毒診斷陽性率分別是86%、98%、12/12和89%。臨床診斷陽性但Tp0462-ELISA反應(yīng)呈陰性的個體中，患者年齡均大于40歲，且RPR滴度均小于1∶4（表1）。

以TPPA法為金標準，用Tp0462建立的間接ELISA法檢測336份血清的靈敏度為91.7%，特異度為98.8%，陽性預測值和陰性預測值分別為98.7%和92.2%，符合率為95.2%（表2）。ROC曲線分析，曲線下面積達到0.997。

與梅毒初篩ELISA試劑盒相比（表2），Tp0462-ELISA檢測336份血清標本的符合率為92.3%，Kappa值為0.846，大于0.75，顯示一致性極好。與上海科華RPR試劑盒相比（表2），Tp0462-ELISA檢測168份梅毒陽性血清標本的符合率為83.9%，Kappa值為0.293，小于0.4，一致性較差。Tp0462-ELISA檢測168份梅毒陽性標本的A值與RPR滴度分布經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，rs=0.286，P=0.02，沒有相關(guān)性。

表1 Tp0462-ELISA對臨床各期梅毒患者的診斷陽性率

表2 Tp0462-ELISA與TPPA、梅毒初篩ELISA試劑盒（LZ-ELISA）及RPR試劑盒的診斷評價比較

討 論

目前臨床上梅毒的診斷主要依賴于血清學檢測，如TPPA、ELISA等［6］。TPPA試驗是目前公認的梅毒確證方法，但其價格昂貴，數(shù)據(jù)不易保存，難以自動化且不能用于療效和再感染的判斷。市售的膠體金法雖然簡便快速，但存在低濃度難以檢出，假陰性反應(yīng)等問題。TRUST/RPR一般用于梅毒的療效判斷，但病毒感染、自身免疫病、嗜異性抗體等因素容易引起假陽性反應(yīng)，且不能作為梅毒的確診試驗。而以Tp為基礎(chǔ)的血清學試驗尤其是ELISA和化學發(fā)光法操作簡便，重復性、靈敏度和特異度均較好，且易于實現(xiàn)自動化。但對于相同的標本，不同試劑盒之間因檢測的對象不同（IgG/IgM抗體）結(jié)果可能會不完全一致［7］。此外，目前的ELISA試驗還無法用于梅毒療效的判斷。因此，本研究希望從Tp菌體中尋找到既可以用于梅毒的診斷，又能用于梅毒療效判斷的蛋白。

活Tp感染和滅活Tp接種誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原存在一定差異，活Tp在感染階段可能新合成分泌了一些抗原到菌體內(nèi)外或細胞質(zhì)，以調(diào)控宿主細胞信號轉(zhuǎn)導通路，介導Tp與宿主細胞間的相互作用，從而在梅毒感染早期的炎癥反應(yīng)及宿主體內(nèi)持續(xù)慢性感染過程中發(fā)揮重要作用。由于這些抗原蛋白是在活Tp早期感染階段合成分泌的，并不是Tp菌體膜蛋白，我們稱其為體內(nèi)誘生抗原。本研究初步證實，Tp0462可能為一種體內(nèi)誘生抗原。這類抗原與以往的膜蛋白是不同類型的抗原，其診斷性能可能與以往的診斷抗原有著不同的特點。

Tp0462由392個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約40 000，與Tp0136、Tp0134等屬于同一家族［8］。它是一種目前功能未知的假定蛋白，經(jīng)生物信息學分析，推測Tp0462具有信號肽，可能是一種分泌蛋白，且具有多個抗原表位區(qū)。用Tp0462蛋白建立的ELISA檢測336份血清，具有較高的靈敏度（97.0%）和特異性（98.8%）。ROC曲線下面積為0.997，提示Tp0462診斷價值較高，可以作為梅毒的診斷抗原使用。但Tp0462在一期梅毒和隱性梅毒檢測中的陽性檢出率分別為86%和89%，提示該蛋白不太適用于早期感染和潛伏感染診斷。因胎傳梅毒只有4例，未進行分析，我們會在后續(xù)研究中繼續(xù)收集胎傳梅毒標本進行評價。

與目前診斷金標準TPPA及麗珠梅毒初篩ELISA試劑盒相比，Tp0462-ELISA法具有較高的符合率。本研究顯示，Tp0462-ELISA檢測結(jié)果為假陰性的血清樣本有14例，對應(yīng)患者年齡均大于40歲，我們推測年齡可能與這一結(jié)果有關(guān)，也可能與這部分患者抗體水平低下有關(guān)。且樣本RPR的滴度均小于1∶4，提示有可能與血清抵抗（血清固定）現(xiàn)象有關(guān)，也就是這部分患者可能經(jīng)歷了梅毒感染到治愈的過程，導致了Tp0462-ELISA-IgG結(jié)果從陽轉(zhuǎn)陰。后續(xù)研究中，我們將收集隨訪的各期梅毒患者（從就診到治愈期間）標本來驗證。

傳統(tǒng)的ELISA試驗雖然具有較高的靈敏度和特異性，但不能用于區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，亦不能作為梅毒判愈的指標。以非Tp為基礎(chǔ)的血清學試驗主要有TRUST試驗、RPR試驗和性病研究實驗室實驗（VDRL），測定的是反應(yīng)素，它們的滴度變化通常與疾病的活躍程度有密切關(guān)系，可作為梅毒的判愈實驗。反應(yīng)素包含了卵磷脂、膽固醇和心磷脂，而這些物質(zhì)并不是在Tp感染后所特有的，因此這些試驗一般不用于梅毒的診斷。這些血清學試驗在肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及類風濕性關(guān)節(jié)炎患者和一些老年人中常常會出現(xiàn)假陽性。RPR和VDRL的靈敏度取決于疾病的進程，有報道稱在一期梅毒中二者的靈敏度分別為86%和78%，而在二期梅毒中二者的靈敏度可達到100%［9］。本試驗中，RPR試驗與Tp0462-ELISA法的符合率為83.9%，但Kappa值僅為0.293，小于0.4，一致性較差，反映了這兩種方法在梅毒初篩中的差異性［10］。RPP/TRUST的主要意義在于評價梅毒的治療效果以及判斷梅毒再感染。如若找到某種蛋白，既可用于梅毒的診斷，又能評判梅毒治療效果，無論從梅毒診斷還是從降低梅毒治療的成本來說，都將是一種福音。

本研究篩選的Tp0462在與TPPA試驗及麗珠梅毒初篩ELISA試劑盒比較中顯示了良好的診斷性能。與TPPA試驗結(jié)果相比，Tp0462-ELISA試驗診斷靈敏度（91.7%）和特異度（98.8%）均較高，反映了其作為梅毒初篩試劑盒極高的靈敏度，可防止漏檢。此外，我們建立的Tp0462-ELISA與麗珠梅毒初篩ELISA試驗的符合率達92.3%，Kappa值（0.846）亦較高，但Tp0462-ELISA的A450值與RPR滴度變化均呈弱正相關(guān)，尚無法替代傳統(tǒng)的臨床判愈試驗（RPR、TRUST）。如前所述，單個蛋白的診斷效果可能比不上多個重組蛋白聯(lián)合檢測，因此本研究下一步準備通過生物信息學分析和動物實驗，篩選出更多Tp體內(nèi)優(yōu)勢抗原及Tp0462的優(yōu)勢表位肽段，合成多聚肽，并建立ELISA方法，期望合成的Tp多抗原多聚肽能在梅毒的診斷中具有更高的靈敏度和特異性，能為將來梅毒臨床判愈試驗提供新的研究基礎(chǔ)。