多孔木霉色素的結構鑒定和合成基因簇分析

洪 虹，岳 雪，李大成，王炳全，董惠鈞

(1.聊城市人民醫(yī)院腎內科，山東 聊城 252000；2.聊城大學 藥學院，山東 聊城 252000；3.聊城大學 生物制藥研究院，山東 聊城 252000)

環(huán)孢菌素是十一環(huán)肽的免疫抑制劑，是由絲狀真菌多孔木霉(Tolypocladiuminflatum)合成的環(huán)肽次級代謝產物，主要用于器官移植免疫排斥和類風濕性關節(jié)炎、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紫癜以及銀屑病等自身免疫疾病的治療[1]。隨著臨床研究的深入，環(huán)孢菌素A在膜性腎病、腎病綜合征以及IgA腎病方面顯示出良好的治療效果[2-4]。

T.inflatum在分泌環(huán)孢菌素A過程中，會分泌一種色素，而且色素與環(huán)孢菌素A的合成相互影響，但其中的機制并不明了。通常，真菌分泌的色素主要是聚酮類和蒽醌類，都由聚酮合酶(PKS)催化合成[5-7]。研究最深入的真菌色素是紅曲菌產生的紅曲色素，其PKS合成基因簇已被克隆和鑒定[8-9]。謝娜娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)：紅曲菌的色素和毒素桔霉素分別由獨立的PKS合成基因簇控制合成，而且兩者的合成途徑相互影響，將編碼紅曲色素的pksPT基因敲除后，紅曲菌不再產生任何色素，而且桔霉素產量提高了2.8倍，推測桔霉素和色素的合成互相競爭小分子前體物。彭瑤等[11]發(fā)現(xiàn)不同的色素合成基因簇缺失對井岡霉素的合成有不同的影響，多巴類黑色素與井岡霉素的生物合成過程競爭共同前體酪氨酸，將多巴類黑色素基因簇敲除可以提高井岡霉素的產量。

本文旨在通過全基因組挖掘技術分析T.inflatumPKS基因合成基因簇，并進一步解析與色素合成相關的基因簇或基因，為研究T.inflatum中環(huán)孢菌素A和色素合成之間的相互作用關系提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

460型紅外光譜儀，美國尼高力公司；UV3600 型紫外可見分光光度計，日本島津公司；1100LC/MSD 型質譜儀、PrepHT制備型色譜柱 (21.5 mm×150 mm)，美國安捷倫公司；Mercury Plus 400 型核磁共振波譜儀，美國瓦里安公司；PE2400 II 型元素分析儀，美國鉑金埃爾默公司；P270 型制備型高效液相色譜儀，大連依利特公司。

甲醇、乙腈、乙醇及氯仿等試劑均為分析純，汕頭西隴化工公司；氘代水，上海金穗生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1T.inflatum色素的分離純化

按照前期工作提供的方法[12]從T.inflatum培養(yǎng)液中分離純化色素，主要步驟分為固液分離、柱層析和高壓制備液相。首先，收集T.inflatum培養(yǎng)液2 000 mL，減壓過濾去除菌絲體，用體積分數(shù)30%乙醇淋洗濾餅2次，收集濾液上樣弱極性大孔吸附樹脂 X-5 層析柱，收集流出液。其次，減壓濃縮除去乙醇，用低沸點石油醚(70～90 ℃)萃取2次，合并萃取相并經減壓濃縮至干。用氯仿-甲醇-水混合流動相(體積比為50∶ 40∶ 10)溶解上述濃縮物，過濾除去不溶性雜質，上48～75 μm層析硅膠柱，觀測紅色素層析帶的位移并收集紅色素部分。最后，將收集的紅色素溶液減壓濃縮至干，再通過制備型高效液相色譜分離純度大于99%的紅色素。制備高效液相色譜流動相為氯仿-甲醇-水混合溶液(體積比為10∶ 70∶ 20)，流速 5 mL/min，檢測波長為 237 nm，收集高純度流出液，60 ℃減壓濃縮，40 ℃真空干燥獲得色素純品，色素的純度由 HPLC 檢測分析，由歸一化法計算純度，然后對制得的紅色素粉末進行結構鑒定。

1.2.2T.inflatum色素的分析鑒定

參照文獻[12]的方法對高度純化的T.inflatum分泌的色素進行紫外、紅外光譜、質譜、元素分析和核磁共振分析。

1.2.3 PKS基因簇預測分析

采用在線分析軟件antiSMASH(http://antismash.secondarymetabolites.org)對T.inflatum的全基因組(ID：AOHE00000000)進行分析，解析其次級代謝基因簇。

1.2.4 色素合成基因簇相關基因分析

首先使用NCBI蛋白結構在線數(shù)據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對預測的各開放閱讀框(ORF)進行蛋白保守結構域分析；再用在線保守功能域搜索工具Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)驗證結構域分析結果。最后采用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析，預測基因功能。

采用ExPASy(http://www.expasy.org/)在線數(shù)據分析系統(tǒng)分析蛋白性質。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件計算蛋白質的大小、等電點(PI)和氨基酸組成等理化性質。

2 結果與討論

2.1 T. inflatum色素的分離純化結果

T.inflatum色素是在環(huán)孢菌素A生產過程中產生的一種胞外次級代謝產物，使發(fā)酵液呈淺紅至紅棕色。在前期的工作中，筆者所在課題組建立了固液分離、柱層析和高壓制備液相色譜分離紅色素的方法和工藝[12]。筆者在前期工藝的基礎上，對柱層析工藝和高壓制備液相的流動相進行了優(yōu)化和調整。硅膠柱層析的流動相由乙酸乙酯-石油醚(體積比為46∶ 54)變?yōu)槁确?甲醇-水混合流動相(體積比為50∶ 40∶ 10)，高壓制備液相流動相由甲醇-乙腈-水(體積比為42∶ 33∶ 35)變?yōu)槁确?甲醇-水(體積比為10∶ 70∶ 20)，使用改進的流動相分離色素，結果如圖1所示。由圖1可知，色素的純度達到99.1%，能夠達到結構鑒定的要求。

2.2 T. inflatum色素的結構鑒定

在前期的工作中，我們通過紫外和紅外光譜分析初步確定，T.inflatum色素可能為蒽醌類物質[12]。本文中，筆者進一步通過電噴霧電離質譜(ESI-MS)來分析色素，結果見圖2。由圖2可知：色素在m/z為271 處有強吸收的分子離子峰，色素的分子量應為270。

元素分析測定結果發(fā)現(xiàn)：色素中的C元素為 66.4%，H元素為 3.5%，O元素為 29.6%，沒有N、S 和 P元素，初步推斷色素分子式為 C15H10O5，不飽和度為11，應為含有苯環(huán)結構的物質。

進一步采用核磁共振碳譜和氫譜以及二維譜圖對色素進行解析，結果見圖3。由圖3可知：除化學位移δ40附近的溶劑峰外，具有不同化學位移的碳原子共有15個，分別是192.4、182.1、162.5、162.2、154.6、138.2、134.0、133.8、125.2、121.5、120.2、117.9、116.6、115.1和62.9，并且絕大部分類型的碳原子處于化學位移δ100～200的較低場和最低場，因此可判定色素的碳原子數(shù)目為15，而且主要為苯環(huán)上多取代的無氫碳原子。

圖2 色素的ESI-MS分析Fig.2 Analysis of purified pigment by ESI-MS

圖3 色素純品的13C NMR和1H NMR圖譜Fig.3 13C NMR and 1H NMR graphs of purified pigment

通過無畸變極化轉移技術(distortionless enhancement by polarization transfer，DEPT)對核磁共振譜圖進行二次數(shù)據處理，辨別碳譜中的伯碳、仲碳、叔碳和季碳。DEPT90譜圖只顯示次甲基向上的峰，DEPT135譜圖則顯示甲基、次甲基的峰向上，亞甲基峰向下(信號為負)。利用無畸變極化轉移技術對來源于T.inflatum的色素進行DEPT90和DEPT135分析，結果見圖4。由圖4可知：色素中含有5個—CH官能團和1個—CH2官能團。結合氫譜的結果：在位移低場11.94處應為酚羥基氫，數(shù)目為2，其余氫譜位移分別為7.80(t，J=8.0 Hz，1H)，7.68～7.71 (m，2H)，7.39 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.29 (s，1H)，5.62 (brs，1H)，4.63 (d，J=4.0 Hz，2H)。

圖4 DEPT90和DEPT135分析Fig.4 Analysis of purified pigment by DEPT90 and DEPT135

綜上分析，T.inflatum色素的化學結構是含有3個酚羥基和2個酮基的蒽醌類物質(圖5)，經檢索對比，T.inflatum色素與蘆薈大黃素的結構類似。蘆薈大黃素是一種具有抗菌、抗腫瘤和免疫抑制活性的物質，因此，我們推測T.inflatum色素也具有生理活性，下一步我們將對其生物活性開展相關研究。

圖5 T. inflatum色素化學結構式Fig.5 Chemical structure of T. inflatum pigment

2.3 T. inflatum PKS次級代謝基因簇分析

T.inflatum的次級代謝產物豐富，在已測序的基因組中發(fā)現(xiàn)含有豐富的非核糖體肽合成酶基因簇(NRPS)和聚酮合酶基因簇(PKS)[13]，其中環(huán)孢菌素A就是由非核糖體肽合成酶基因簇合成。在培養(yǎng)T.inflatum的過程中發(fā)現(xiàn)，菌株會在分泌環(huán)孢菌素A的同時耦合生成一種紅色素，而且環(huán)孢菌素A產量與紅色素產量呈負相關關系[12]，表明環(huán)孢菌素A與紅色素合成途徑之間有相互作用，但紅色素的生物合成途徑以及與環(huán)孢菌素A合成之間的相互作用機制不清楚。

采用antiSMASH在線軟件對T.inflatum的次級代謝產物進行分析，結果表明：T.inflatum共有43個次級代謝合成基因簇，其中，有13個與非核糖體多肽合成途徑(NRPS)相關，15個與Ⅰ型聚酮合酶(T1PKS)途徑相關，7個與NRPS-T1PKS途徑相關，3個與萜類(terpene)途徑相關以及5個未知功能的基因簇。在15個T1PKS基因簇中，可能的次級代謝產物有白灰制菌素、鐮刀菌紅素、密擠青霉酸和吡里哌若平(表1)。

表1 T. inflatum中Ⅰ型PKS合成基因簇的功能預測

2.4 色素合成基因簇相關基因分析

通過antiSMASH預測的T.inflatum色素合成基因簇，結果見圖6。由圖6可知：該色素的合成基因簇中共有19個開放閱讀框(ORFs)，長度為47.2 kb，其中核心合成基因為編碼甲基轉移酶的ORF59和編碼聚酮合酶的ORF60。除了核心基因外，該基因簇還含有氧甲基轉移酶、丁酰輔酶A還原酶、乙醇脫氫酶和短鏈脫氫酶等酶促基因，還有轉運蛋白和轉錄調控基因，具體分析結果見表2。

圖6 T. inflatum可能的色素合成基因簇Fig.6 Putative biosynthetic gene cluster of T. inflatum pigment

表2 T. inflatum色素合成基因簇中可能的基因功能

2.5 色素PKS合成基因KS保守結構域的進化

PKS合成基因簇中通常由AT和KS結構域組成，其中KS結構域的保守性最強。以T.inflatum色素合成基因簇KS結構域為對象，采用Mega6.0軟件構建了KS結構域系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖7。由圖7可知：預測的色素合成基因簇中KS結構域與T.ophioglossoides的孢子黃色素合成基因蔟處在相同的進化分支，相似度最高；另外，該KS結構域與鐮刀菌紅素以及其他真菌的孢子色素合成基因簇同源性亦很高。

再將預測的色素合成基因簇與3種同源性較高的色素合成PKS基因結構進行對比分析，結果見圖8和表3。由圖8可知，T.inflatum色素與鐮刀菌紅色素以及孢子黃色素的PKS合酶的保守結構域類似，都有PKSD結構域，而且T.inflatum色素和鐮刀菌紅素的分子結構類似,但PKS合酶的大小差異較大,T.inflatum色素的PKS合酶由1 997個氨基酸組成,等電點為5.97,而鐮刀菌紅素的PKS合酶的大小為3 733個氨基酸,等電點為5.32(表3)。通過上述生物信息學方法預測的T.inflatum色素可能的合成基因簇仍需通過實驗進一步驗證。

圖7 真菌色素KS結構域系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of conserved KS domain from fungus

圖8 高同源性的色素PKS合成酶保守功能域Fig.8 Conserved domains of hiher homologous PKS enzymes

色素種類PKS合成酶氨基酸長度(aa)等電點(PI)不穩(wěn)定系數(shù)產物結構孢子黃色素2 2796.1238.6(stable)鐮刀菌紅素3 7335.3241.89(unstable)多孔木霉色素1 9975.9740.21(unstable)

3 結論

通過分離純化方法獲得了T.inflatum色素純品，并鑒定了其化學分子結構，該色素是一種蒽醌類物質，分子式為C15H10O5。通過生物信息學方法進一步分析，初步確定了T.inflatum合成的基因簇，該基因簇長度大約為47.2 kb，編碼43個ORFs，核心基因為PKS合成酶基因，而且PKS合成酶與鐮刀菌紅素的同源性非常高，二者合成的目標產物的結構類似。在下一步中研究中，我們將結合本研究所解析的T.inflatum色素合成途徑，以闡明該色素與環(huán)孢菌素A合成之間的相互關系。

參考文獻：

[1] 劉陽,肖庚富.環(huán)孢菌素A的研究進展及應用[J].生物技術通報,2006(2):21-24.

[2] 雷鳴,張虹.環(huán)孢菌素聯(lián)合科素亞對IgA腎病療效觀察[J].深圳中西醫(yī)結合雜志,2016,26(7):75-76.

[3] 朱玉嫻,張玉強,孫麗君,等.環(huán)孢素A與嗎替麥考酚酯治療難治性腎病綜合征療效對比[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志,2010,11(11):970-973.

[4] 張丹.環(huán)磷酰胺與環(huán)孢菌素A治療膜性腎病的臨床療效研究[J].保健醫(yī)學研究與實踐,2016,13(4):50-51.

[5] TULI H S,CHAUDHARY P,BENIWAL V,et al.Microbial pigments as natural color sources:current trends and future perspectives[J].J Food Sci Technol,2014,52(8):4669-4678.

[6] CHEN Y,FENG P,SHANG Y,et al.Biosynthesis of non-melanin pigment by a divergent polyketide synthase inMetarhiziumrobertsii[J].Fungal Genet Biol,2015,81:142-149.

[7] YANG Y,LIU B,DU X J,et al.Complete genome sequence and transcriptomics analyses reveal pigment biosynthesis and regulatory mechanisms in an industrial strain,MonascuspurpureusYY-1[J].Sci Rep,2015,5:8331-8341.

[8] XIE N,LIU Q,CHEN F.Deletion ofpigRgene inMonascusruberleads to loss of pigment production[J]．Biotechnol Lett,2013,35(9):1425-1432．

[9] BALAKRISHNANA B,KARKI S,CHIU S H,et al.Genetic localization and in vivo characterization of aMonascusazaphilonepigment biosynthetic gene cluster[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(14):6337-6345．

[10] 謝娜娜,張乙平,陳福生.紅色紅曲菌M7中色素聚酮合酶基因敲除突變體的鑒定[J].微生物學報,2015,55(7):863-872.

[11] 彭瑤,蘆晨陽,白林泉.吸水鏈霉菌井岡變種的色素合成基因缺失對井岡霉素產量的影響[J].微生物學報,2016,56(11):1719-1729.

[12] BUSHLEY K E,RAJA R,JAISWAL P,et al.The genome ofTolypocladiuminflatum:evolution,organization,and expression of the cyclosporine biosynthetic gene cluster[J].PLoS Genet,2013,9(6):e1003496.

[13] 董惠鈞,張彤鑫,昌大莉.多孔木霉中紅色素的初步鑒定及其與環(huán)孢菌素A對底物纈氨酸的競爭[J].微生物學通報,2014,41(10):2076-2081.