氨基酸分析研究進展

丁 松，黃 和，胡 燚

(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

蛋白質(zhì)在生物界具有無與倫比的地位，而作為蛋白質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的氨基酸同樣與生命活動息息相關(guān)。參與蛋白質(zhì)合成的基本氨基酸有20種，非蛋白質(zhì)氨基酸在自然界中被發(fā)現(xiàn)的已超過1 000種[1]。氨基酸也可作為能量來源，是神經(jīng)遞質(zhì)、卟啉、多胺和一氧化氮等生物合成的前體[2]。氨基酸分析在生物化學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，也是分析化學(xué)中的一個研究熱點。氨基酸的分析方法紛繁多樣，主要體現(xiàn)在衍生劑、檢測器的種類多，分析方法又優(yōu)劣各異，這無疑給科研工作者的選擇帶來了困難。國內(nèi)外許多研究者從不同角度對氨基酸的分析進行了綜述。于泓等[3]主要對柱前衍生反向高效液相色譜法(HPLC)做了總結(jié)及比較，并著重敘述了高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法在分析氨基酸方面的應(yīng)用。Poinsot等[4-6]連續(xù)多年追蹤報道了毛細管電泳分析氨基酸近20年的研究進展，為毛細管電泳分析氨基酸帶來了重要參考。

本文對無需衍生化的直接檢測氨基酸和需要衍生化的間接測定氨基酸的2種方法進行了綜述，直接檢測法主要從檢測器方面論述近年來主要的檢測非衍生化氨基酸的基本理論及實例；間接檢測法從衍生試劑及相應(yīng)衍生物的檢測器(紫外、熒光和液相-電噴霧離子質(zhì)譜)方面分析了各種衍生試劑的優(yōu)劣及衍生化方法。

1 非衍生化方法

無需進行衍生的直接分析氨基酸方法一直是科研工作者所追求的。非衍生直接分析氨基酸不僅更便捷、靈活、簡單且具有準確性，也能避免引入衍生化過程的重現(xiàn)性，衍生的不穩(wěn)定性以及副反應(yīng)和試劑的干擾等問題。近十多年來，非衍生化分析氨基酸的方法層出不窮。筆者就非衍生分析氨基酸的色譜方法和檢測器進行系統(tǒng)的總結(jié)。

1.1 紫外檢測器

有多種氨基酸帶有芳香基團，比如L-色氨酸、L-酪氨酸和L-苯丙氨酸以及它們的衍生物，都能在紫外254 nm處有吸收峰，其余的氨基酸雖然羧基能在低紫外波長(190～210 nm)處被檢測出，但是敏感度太低。Wadud等[7]用HPLC(Mightysil RP-18 GP分析柱)聯(lián)合紫外檢測器成功分析出了肝臟試樣中的組氨酸，色譜條件為柱溫39 ℃，流速1.2 mL/min，波長220 nm，進樣量10 μL。此外，Agrafiotou等[8]用UV檢測器分析了18種非衍生氨基酸，通過雙波長紫外吸收190和210 nm波來增強分析效果。

1.2 熒光檢測器

熒光能檢測帶有苯酚、鄰苯二酚、吲哚基的氨基酸，如酪氨酸(Tyr)、DL-m-酪氨酸(m-Tyr)、DL-α-甲基酪氨酸(me-Tyr)、β-(3，4-二羥苯基)-L-丙氨酸(dopa)、5-羥基-色氨酸(5htp)、L-a-甲基多巴(me-dopa)、L-色氨酸(Trp)。檢測以上氨基酸的激發(fā)和發(fā)射波長分別為220和320 nm，檢出限在12～58 ng/mL。液相色譜條件為pH 2.5的0.02 mol/L磷酸緩沖液和乙腈作為流動相，流速1 mL/min，進樣質(zhì)量濃度10 μg/mL，柱溫25 ℃[8]。

1.3 電導(dǎo)檢測器

電導(dǎo)檢測在近十幾年興起是因為非接觸電導(dǎo)檢測器(C4D)的引入。傳統(tǒng)的接觸式電導(dǎo)檢測器由于對帶電離子的檢測具有通用性，并且可以用于檢測對紫外-可見光不敏感的離子，受到研究者的重視。但接觸式電導(dǎo)檢測器容易造成電極污染，難以清洗，且難以檢測出谷氨酸[9]。非接觸電導(dǎo)檢測器把交流電壓信號通過電容耦合作用于檢測池，更加有利于裝置的制作，使用也更加方便。有相關(guān)論文報道了C4D用于非衍生氨基酸的檢測，Kubáňp等[10]、Strieglerov等[11]、Shen等[12]和Tuma等[13]用電導(dǎo)檢測器聯(lián)合HPLC分析了 6種氨基酸(纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)，色譜條件為Purospher RP-18e 柱，流速0.7 mL/min，流動相A為體積分數(shù)0.002 5%三氟乙酸，流動相B為體積分數(shù)0.001 5%三氟乙酸和體積分數(shù)10%甲醇，分析物濃度為500 μmol/L。C4D在高效液相色譜的應(yīng)用中會由于梯度洗脫造成基線漂移，這種情況可以通過合理的調(diào)電導(dǎo)率、緩沖溶液比例及合理使用軟件等來改善[14]。

1.4 蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)

蒸發(fā)光散射檢測(ELSD)是目前公認的被用于液相色譜的通用檢測方法。與紫外檢測器相比， ELSD通用性更高，其響應(yīng)作用與物質(zhì)的本身結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)無關(guān)?？芍苯訖z測無紫外吸收或熒光官能團物質(zhì)，對直接檢測未衍生氨基酸十分適用。ELSD相對于質(zhì)譜來說廉價得多，但靈敏度較低，響應(yīng)值常與被測物濃度不呈線性關(guān)系。近年來，許多研究者針對ELSD的改進做了不少工作，如：Petritis等[15]用HPLC結(jié)合揮發(fā)性離子對試劑全氟羧酸和蒸發(fā)光散射檢測器驗證檢測了8種非衍生氨基酸(蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)，氨基酸樣品粉末用體積分數(shù)為0.1%的七氟丁酸溶解，色譜條件為Purospher RP18e柱(Merck;125 mm,4 mm)，柱溫25 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。與標準氨基酸分析儀檢測的方法保持98.6%～102.5%的結(jié)果一致。ELSD也被應(yīng)用于一些真實樣品非衍生氨基酸的檢測，如水蛭、茶等[16-17]。Cobb等[18]通過減小噴霧器管道直徑(0.254～0.127 mm)來改善ELSD檢測非衍生氨基酸的基線穩(wěn)定性、靈敏度和線性相關(guān)性，取得了良好的效果。

1.5 質(zhì)譜檢測器

在過去的十多年中，質(zhì)譜檢測技術(shù)為天然氨基酸的測定提供了新的機會。目前用于分析復(fù)雜生物基質(zhì)中氨基酸的質(zhì)譜都是和各種檢測工具聯(lián)用的，主要有液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳。無需衍生化的直接分析氨基酸的方法有離子對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(IP-LC-MS/MS)、親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HILIC-MS)和毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等。Piraud等[19]在20 min內(nèi)運用反相高效液相質(zhì)譜(IP-HPLC-MS)定性測定了76種氨基酸，其中通過穩(wěn)定同位素標記物內(nèi)標法，有16種氨基酸可以定量測定。色譜條件為十八烷基鍵合硅膠柱，柱溫26 ℃，以全氟羧酸和乙腈為流動相，流速200 μL/min，進樣量5 μL。Armstrong等[20]通過離子對反相高效液相色譜(IP-RP-HPLC)/耦聯(lián)時間飛行質(zhì)譜(TOF-MS)對人體血液中25種未衍生氨基酸進行了定量測定，線性動態(tài)范圍在1.56～400 μmol/L。Langrock等[21]在25 min內(nèi)運用聚酰胺柱結(jié)合親水色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜(HILIC-ESI-MS)，在中性丟失掃描模式下分離出了16種蛋白氨基酸[21]。Qi等[22]用0.08 mmol/L鄰苯二甲酸作為流動相添加劑，通過HILIC-ESI-MS測定甲狀腺癌組織中的氨基酸，定量限(LOQ)和檢測限(LOD)相較于未加添加劑提升了4～50倍。Rodrigues等[23]用毛細管電泳-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(CE-ESI-MS)定量分析了尿液中的27種氨基酸，分析時間在30 min之內(nèi)，檢測限達到0.6～29 μmol/L。

1.6 積分脈沖安培檢測器(IPAD)

積分脈沖安培檢測器(IPAD)的原理是氨基酸中的羧基在強堿性條件下變成陰離子，而氨基只有在金電極表面施加一定電位才能發(fā)生氧化反應(yīng)，積分脈沖安培檢測器從而實現(xiàn)了對氨基酸的檢測，檢出限為pmol～fmol級。Yu等[24]對高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法(HPAEC-IPAD)分析氨基酸的影響因素進行了考察，洗脫液氫氧化鈉和醋酸鈉的濃度在一定限度的增高會提高氨基酸檢測的敏感度，在優(yōu)化的條件下，19種氨基酸的檢測限為0.15～4.52 pmol。色譜條件為AminoPac PA 10柱(250 mm×2 mm)，流速0.25 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量25 μL。因為糖類化合物也含有多羥基，會導(dǎo)致有糖及糖類化合物存在時影響氨基酸的分析。由于氨基酸的檢測點位高于糖類化合物，在較高的電位下，兩者均被檢測，而在較低的積分電位下只能檢測糖類化合物，氨基酸(羥基氨基酸除外)很難被檢測或檢測信號很弱。對含有大量糖類化合物樣品中的氨基酸進行測定，Jandik等[25]和Ding等[26]分別提出了在線和離線除糖測定氨基酸的方法。

2 衍生化方法

最普遍的定性和定量分析氨基酸的方法涉及高效液相色譜和各種檢測器的耦合系統(tǒng)，這種方法不可避免地要引入衍生試劑。許多氨基酸在相應(yīng)的檢測器下沒有吸收峰，只有和衍生試劑反應(yīng)生成相應(yīng)的衍生物才能在檢測器中被檢測出來。筆者就3種不同的檢測器(紫外檢測器、熒光檢測器和電噴霧電離質(zhì)譜檢測器)及對應(yīng)的衍生劑、衍生化方法進行了綜述，旨在滿足科研工作者對氨基酸分析方法的選擇具有多樣性。

2.1 紫外檢測

紫外檢測器在氨基酸分析中是最常見的。1958年，Spackman等[27]讓氨基酸首先在酸性環(huán)境中形成陽離子，進而在陽離子交換柱中進行分離，然后用茚三酮衍生分離后的氨基酸，最后采用紫外檢測器進行檢測，奠定了現(xiàn)代氨基酸自動分析技術(shù)的基礎(chǔ)。隨后，各種衍生試劑及衍生方法隨之涌現(xiàn)，詳見表1。紫外吸收衍生試劑主要有異硫氰酸苯酯(PITC)、4-硝苯基異硫氰酸苯酯(NPITC)、異硫代氰酸丁酯(BITC)、芐基異硫氰酸酯(BZITC)、茚三酮、2，4-二硝基氟苯(FDNB)、磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABS-Cl)、N-N-二乙基 -2，4-二硝基-5-對氟苯胺(FDNDEA)、乙氧亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)和4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯(CDNBTF)等。

作為一種常用衍生試劑，PITC廣泛應(yīng)用于氨基酸分析領(lǐng)域[28-31]。它可同時與一級和二級氨基快速發(fā)生反應(yīng)，生成穩(wěn)定的苯氨基硫甲酰衍生物(PTC)，PTC在紫外254 nm處有很好的吸收峰。Okunev等[31]用PITC衍生土壤溶液中的17種蛋白氨基酸，分析時間達72 min，其中35 min進行衍生化反應(yīng)，37 min用于色譜分離，其檢測限為0.22～0.48 pmol。色譜條件為Brownlee Analytical C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相A為0.05%三乙胺，流動相B為乙腈-水(體積比為60∶ 40)，進樣量20 μL。Cohen等[32]在保留PITC各種優(yōu)點的基礎(chǔ)上為了提高檢測的敏感性，首次運用了PITC的類似物4-硝苯基異硫氰酸苯酯(NPITC)作為氨基酸的衍生試劑，檢測波長為254或340 nm，總檢測時間為40 min。但NPITC的一大不足是在高真空系統(tǒng)下，過量的試劑無法被簡單移除。要解決這個問題，就亟需開發(fā)易揮發(fā)的衍生試劑，異硫代氰酸丁酯(BITC)應(yīng)時而生。BITC除了有很好的揮發(fā)性以外，還兼有分離胱氨酸和半胱氨酸的能力，這是PITC所不具有的，但美中不足的是天冬酰胺和絲氨酸峰完全重疊。芐基異硫氰酸酯(BZITC)作為PITC的類似物，BZITC的揮發(fā)性雖然沒有BITC的好，但同PITC相比，在相同條件下具有更好的反相分辨率和再現(xiàn)性。Woo等[33]以BITC和BZITC作為食品中22種氨基酸分析的衍生劑，并同PITC作比較。BITC和BZITC的衍生物檢測波長分別為240和246 nm，分析時間都為35 min，BITC衍生對于過量的試劑和副產(chǎn)物的移除只要10 min，而PITC和BZITC要花費1 h。

表1 紫外衍生試劑特點的比較

注：RT代表室溫;pre-column表示柱前；post-column表示柱后；simple表示去除蛋白加一個額外的操作步驟(例如去除過量試劑或干擾物質(zhì))；complex表示去除蛋白加2個及以上額外的操作步驟。

2，4-二硝基氟苯(DNFB)(Sanger試劑)，又稱作1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)，是一種通用的、廉價的氨基酸柱前衍生試劑，它能與一級和二級氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯(DNP)氨基酸。DNP氨基酸在紫外360或365 nm處有強的吸收峰。與DNFB結(jié)構(gòu)類似的4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯(CDNBTF)也常見于氨基酸分析[34-36]。CDNBTF亦能檢測一級和二級氨基，反應(yīng)式如圖1所示，衍生物穩(wěn)定，吸收波長260 nm，分析時間45 min。Lin等[35]運用CDNBTF作為老陳醋中氨基酸的衍生劑，然而這種操作方法實施時亮氨酸和異亮氨酸不能分開。

圖1 CDNBTF和氨基酸的衍生反應(yīng)Fig.1 CDNBTF and amino acid derivatization

磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABS-Cl)作為一個氨基酸柱前衍生試劑得到了相當大的關(guān)注。DABS-Cl有許多PITC所沒有的優(yōu)點，其氨基酸的衍生物在室溫下能穩(wěn)定數(shù)周，檢測限達到了pmol級，在紫外430～460 nm處有很強的吸收峰[37-38]。缺點是與一些氨基酸(精氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和天門冬氨酸)不能進行定量反應(yīng), 而且產(chǎn)物成分復(fù)雜。

乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)是近年來比較受歡迎的一種衍生試劑，與氨基酸的反應(yīng)如圖2所示，其衍生物穩(wěn)定，紫外檢測波長為280 nm。Megías等[39]用DEEMM柱前衍生化方法檢測了L-刀豆氨酸，LOD和LOQ分別為0.15和0.5 μmol/L。Redruello等[40]用DEEMM定量分析了奶酪中的22種氨基酸，檢測限為0.08～3.91 μmol/L，衍生時間45 min，但還須70 ℃加熱2 h，以降解過量的DEEMM和副產(chǎn)物，操作較為繁雜和耗時。也有研究者對蜂蜜中的23種氨基酸分析進行，雖然取得了良好的分析效果，但唯一不足的是衍生結(jié)束后要等24～48 h才能用HPLC分析[41]。

圖2 DEEMM與氨基酸的衍生反應(yīng)Fig.2 DEEMM and amino acid derivatization

2.2 熒光檢測

熒光衍生試劑有3-(4-羧基苯甲?；?-2-喹啉吡咯甲醛(CBQCA)、異硫氰酸熒光素(FITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、熒光胺(FRA)、4,7-菲咯啉-5,6-二酮(PHA)和鄰苯二甲醛(OPA)等，以上試劑各自特點見表2。

異硫氰酸熒光素(FITC)是一種熒光衍生試劑，與氨基酸反應(yīng)的衍生物激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長515 nm[43]。它有3方面優(yōu)勢:1)氬氣燈的發(fā)射波長與FITC的激發(fā)波長一致；2)很容易與氨基酸發(fā)生衍生反應(yīng)，衍生物的熒光效果好；3)能通過微波輔助衍生把衍生時間降到3 min[44]。

表2 熒光衍生試劑特點的比較

注：Ex.為激發(fā)波長;Em.為發(fā)射波長。

最近二十多年來，柱前OPA衍生方法分析氨基酸很受歡迎。除了胱氨酸和半胱氨酸，OPA能在2-巰基乙醇或3-巰基丙酸存在的條件下，與一級氨基酸反應(yīng)生成熒光化合物[45]，激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長455 nm。OPA衍生的優(yōu)點很多，衍生時間可快至1 min，靈敏度達到fmol級，基本沒有副產(chǎn)物生成，同時還具有穩(wěn)定的色譜基線，不存在不規(guī)則峰形的特點[46-47]。新的衍生試劑萘-2，3-二甲醛(NDA)的設(shè)計是為了解決OPA衍生物降解快的問題(大約10 min)[48]，但價格對于OPA來說貴得多，熒光檢測的激發(fā)和發(fā)射波長分別為420和483 nm。OPA也可以進行柱后衍生，比茚三酮靈敏度高，是一種應(yīng)用廣泛的柱后衍生試劑。柱后衍生試劑還有熒光胺，熒光胺是一種螺環(huán)化合物，于1972年由Udenfriend等[49]首次提出，隨后Weigele等[50]在實驗室合成了該化合物。熒光胺本身無熒光吸收，能與一級氨基化合物在pH為9的硼酸緩沖液中反應(yīng)生成藍綠色熒光衍生物，該衍生物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為390和475 nm[51]。但OPA和熒光胺不能直接與脯氨酸反應(yīng)，須通過氧化打開脯氨酸的咪唑環(huán)才能衍生。但Pravadali-Cekic等[52]和Jones等[53]用反應(yīng)流色譜聯(lián)合UV檢測器，熒光胺作為柱后衍生劑，在UV 280 nm處分析了氨基酸，并且LOD和LOQ相比較于傳統(tǒng)柱后衍生減小了50%，是今后氨基酸柱后衍生的一個新的方向。

CBQCA試劑在水溶液中沒有熒光，然而在氰化物的存在下，它能與一級氨基在室溫下發(fā)生反應(yīng)，生成強的熒光吸收的衍生物，反應(yīng)如圖3所示。該衍生物在熒光檢測器下的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為465和550 nm，檢測限在0.03～0.06 μmol/L[54]。4,7-菲咯啉-5,6-二酮(PHA)也能與一級氨基生成穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，反應(yīng)如圖4所示，其衍生物激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為400和460 nm，LOD和LOQ分別為10～450和35～1 400 fmol[55-56]。

圖3 CBQCA與氨基酸的衍生反應(yīng)Fig.3 CBQCA and amino acid derivatization

圖4 PHA與氨基酸衍生反應(yīng)Fig.4 PHA and amino acid derivatization

2.3 紫外和熒光檢測

一些衍生劑和氨基酸反應(yīng)既能用紫外檢測，也能用熒光檢測。常用的這種衍生試劑有6-氨基哇琳基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯(AQC)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑(NBD-F)、4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD-Cl)等，各自特點比較見表3。

表3 紫外兼熒光衍生試劑特點的比較

柱前衍生試劑6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯(AQC)最初是由Cohen[57]等首次提出的，作為一種特殊的分析蛋白質(zhì)和水解氨基酸的熒光衍生試劑[58]，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是250和395 nm[59]。同時，AQC也是紫外衍生試劑，紫外檢測波長250 nm，其與氨基酸的反應(yīng)如圖5所示。Pappa-Louisi等[59]和Wang等[60]以AQC作為氨基酸衍生劑，同時用紫外和熒光檢測器分別分析氨基酸。AQC能與一級和二級氨基酸反應(yīng)，反應(yīng)時間短，衍生物穩(wěn)定。但樣品中有羥脯氨酸和羥基賴氨酸時，定量分析會受到反應(yīng)副產(chǎn)物的干擾。丹磺酰氯(Dansyl-Cl)也是近年來氨基酸分析常用的衍生試劑，能與一級和二級氨基反應(yīng)，衍生物紫外檢測波長250 nm，熒光檢測激發(fā)波長330 nm，發(fā)射波長550 nm。衍生須要在避光條件下反應(yīng)，衍生時間較長，衍生完要立即進樣分析，避免產(chǎn)生多級衍生物。Dansyl-Cl與組氨酸容易形成雙峰，重復(fù)性差，但其胱氨酸的衍生物線性關(guān)系好，是胱氨酸定量分析的一種優(yōu)良衍生試劑。

9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)與氨基酸反應(yīng)(圖6)，反應(yīng)速度快，可在30 s內(nèi)完成，其衍生物紫外檢測波長在254～286 nm[61-62]，熒光檢測激發(fā)和發(fā)射波長分別為254和313 nm[63]。但試劑本身和其水解物有熒光，對色譜分離會產(chǎn)生干擾；組氨酸與其產(chǎn)生的衍生物不穩(wěn)定，繼而影響定量分析。

圖5 AQC與氨基酸衍生反應(yīng)Fig.5 AQC and amino acid derivatization

圖6 FMOC-Cl與氨基酸衍生反應(yīng)Fig.6 FMOC-Cl and amino acid derivatization

4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(NBD-Cl)是一級和二級氨基酸的柱前衍生試劑，NBD-Cl有許多優(yōu)點、它的價格低廉、和氨基酸反應(yīng)的衍生物能同時被紫外和熒光檢測器檢測、副產(chǎn)物很少[64-65]。紫外檢測波長為470或475 nm，熒光檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是488和520 nm[66-67]。4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑(NBD-F)能與一級和二級氨基反應(yīng)，敏感度高，在一般情況下其分析時間長，達到80 min，導(dǎo)致分析不便捷，尤其是在臨床醫(yī)療領(lǐng)域。然而，Song等[68]運用其與硅膠整體柱的快速HPLC方法，應(yīng)用于小鼠血漿19種氨基酸分析中，整個分析過程只要18 min，效率明顯提高，其熒光檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為470和530 nm，紫外檢測波長為380 nm。

2.4 液相-電噴霧離子質(zhì)譜的檢測

雖然液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)能提供低的檢測限，但是還要依靠電噴霧的有效離子化。最近幾年，專門用作毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS)的氨基酸衍生試劑越來越多地被設(shè)計出來： 3-aminopyridyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamate(APDS)、N-alkylnicotinic acidN-hydroxysuccinimideester(Cn-NA-NHS)、p-N,N,N-trimethylammonioanilylN′-hydroxysuccinimidylcarbamateiodide(TAHS)、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl ntri(pyrrolidino) phosphoranylideneamino carbamate(FOSF)和(5-N-succinimidoxy-5-oxopentyl)triphenylphosphoniumbromide(SPTPP)等(結(jié)構(gòu)式見表4)。

表4 LC-ESI-MS檢測衍生劑結(jié)構(gòu)

這些不同的衍生試劑中，APDS能進行更好的色譜分離，SPTPP和TAHS只有在正離子模式下才能靈敏地分析。TAHS被認為是這些新型衍生劑中最靈敏的[70]。Inagaki等[71]合成了SPTPP，SPTPP衍生物的檢測限為0.015～0.43 fmol。Rebane等[72]用TAHS、FOSF、傳統(tǒng)衍生試劑Dansyl-Cl、FMOC-Cl和DEEMM比較分析了7種不同的氨基酸，但結(jié)果表明雖然這些新型衍生試劑靈敏度高，但是色譜分離效果沒有DEEMM好，線性范圍沒有DEEMM廣。在液相-電噴霧離子質(zhì)譜檢測所用到的衍生試劑是近幾年所興起的新型衍生試劑，對氨基酸的分析起到一定的推動作用，也是今后氨基酸分析的一個新的熱點。

3 展望

氨基酸的分析方法多樣，其中柱前衍生高效液相色譜法是研究的比較多的一種方法，其發(fā)展方向主要集中在柱前衍生劑的穩(wěn)定性、靈敏度和重復(fù)性上。當然，無需衍生的氨基酸分析方法將有更大的發(fā)展空間，各種檢測器的更新?lián)Q代以及各種分析設(shè)備的聯(lián)用無疑為直接分析氨基酸提供了更加有力的保障，氨基酸的分析速度、靈敏度和重復(fù)性將會在未來走上一個新的臺階。

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