結核T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗在診斷結核病中的臨床應用價值*

施瑞潔,韓夢箐 ,馬 娟,張利俠,朱 娜 ,杜 潔

1.陜西省人民醫(yī)院檢驗科(西安710068),2.陜西中醫(yī)藥大學檢驗系(咸陽712046)，3.陜西省人民醫(yī)院科研處(西安710068)，4.陜西省人民醫(yī)院健康體檢中心(西安710068)

結核病是一種主要通過空氣傳播的傳染性細菌感染性疾病，據(jù)報道，2014年世界范圍內有 960萬例結核感染患者，其中150萬例死于結核病[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計，我國結核病患病人數(shù)居世界第二位，僅次于印度；我國不僅是全世界27個嚴重流行耐多藥結核病的國家之一，同時也是全世界22個結核病流行嚴重的國家之一[2]。流行病學調查發(fā)現(xiàn)因結核病而導致死亡的人數(shù)達到13萬人/年[3]，國家衛(wèi)計委已將結核病例為全國重點控制重大疾病之一[4]。

有研究顯示各國結核病的診斷均存在不同程度的診斷延誤[5-6]，而診斷延誤可導致患者感染期的延長以及病情的惡化, 不但增加了患者和社會的經濟負擔, 還可能導致結核疫情加劇，出現(xiàn)更多的感染者及更高的病死率。早期篩檢出結核病患者，縮短從出現(xiàn)癥狀到確診為結核的時間，并給以合理治療, 是控制和消滅傳染源、減少感染、降低發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[7-8]，因此快速精準的早期篩查和檢測結核菌感染尤為重要。

由于傳統(tǒng)的檢測結核病的方法存在缺陷，不能早期、有效的篩查出結核病，我們引入了新的檢測方法-結核T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗(T-SOPT.TB)。T-SOPT.TB是在酶聯(lián)免疫斑點技術(ELISPOT)的基礎上應用細胞免疫反應建立起來的檢測單細胞水平分泌抗體或細胞因子的新型體外免疫檢測法[4]。本研究應用T-SOPT.TB檢測2016年5-12月某院160例結核病患者與46例非結核病患者外周抗凝血單個核細胞結核特異性T淋巴細胞數(shù)、紅細胞沉降率及涂片抗酸染色并分析。

材料與方法

1 研究對象 選取2016年5-12月某院確診為結核病患者160例為病例組，其中男97例，女63例，平均年齡57.1819.52歲。納入標準：臨床表現(xiàn)結核癥狀，影像學、病理或抗酸染色確診為結核，排除妊娠，均未服用免疫抑制藥物。另選對照組46例，男25例，女21例，平均(61.3617.63)歲。納入標準：既往均無結核病史及結核病接觸史，胸部經X線檢查無異常。病例組與對照組的年齡及性別比較差異無統(tǒng)計學意義。

2 標本采集

2.1 T-SOPT.TB試驗：肝素鋰抗凝管常規(guī)采集靜脈血5ml。標本采集后4h內送至實驗室。

2.2 涂片抗酸染色：痰標本采用合格的新鮮晨或液體標本經離心后取沉淀涂片，利用抗酸染色鏡檢。

2.3 紅細胞沉降率檢測 ：專用血沉真空管常規(guī)抽取空腹靜脈血1.6ml。

3 試劑及儀器 淋巴細胞分離液和AIM-V培養(yǎng)液由美德太平洋(天津)生物科技股份有限公司提供；RPMI-1640培養(yǎng)基由天津生物科技有限公司提供；檢測結核T淋巴細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗試劑盒由英國牛津提供：PBS洗板液由上海雙螺旋生物科技有限公司提供；酶結合物原液；無菌試管；無菌加樣頭；定量加樣器；生物安全柜；37℃培養(yǎng)溫箱；無菌痰杯；抗酸染色劑；ESR-030血沉儀；含有0.4ml，濃度為0.109mol/L檸檬酸鈉的專用血沉真空管。

4 方 法

4.1 T-STOP.TB試驗方法：按照標準操作規(guī)程將外周抗凝血分離單個核細胞，將其洗滌，計數(shù)并稀釋至2.5×106個/ml的工作濃度細胞液，在微孔板中分別加入陰性對照細胞培養(yǎng)液，抗原A(ESAT-6，結核桿菌早期分泌蛋白)，抗原B(CFP10，培養(yǎng)濾液蛋白10)，陽性對照(植物血凝素PHA)各50μl，每孔分別加入100ul稀釋好的細胞液(懸空加入，不沾染板孔)，放入CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)培養(yǎng)16～20h。次日準備10×PBS液(PBS蒸餾水稀釋得到)，以1∶200的比例將酶標二抗原液與10×PBS洗滌液混合制成二抗工作液，將過夜培養(yǎng)的板孔中的培養(yǎng)液甩掉，每孔加入200μl 10×PBS液洗板，重復4遍后拍干板孔，每孔加入50μl二抗工作液4～80C孵育1h，洗滌微孔板加入顯色液避光靜置5～10min，用蒸餾水洗滌終止反應。將孔板內的液體拍干，讀取并記錄結果。

4.2 紅細胞沉降率檢測方法：病人空腹時，使用專用血沉真空管采集靜脈血，混勻后將血沉管豎直置于ESR-030自動血沉分析儀,30min后查看結果。

4.3 痰涂片抗酸染色方法：病人清晨漱口后深咳送檢，取痰液涂片后紫外消毒30min后置于加熱臺熱固定1～2min；將石碳酸復紅蓋滿玻片，常溫染色10min后用流水沿玻片一端沖洗10～20s；滴加酸性酒精蓋滿玻片，脫色1～2min后流水沖洗；滴加亞甲藍溶液，覆滿玻片染色30s后用流水沖洗，濾紙擦干后可觀察。

4.4 T-STOP.TB試驗判斷標準：當陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個時(抗原A或抗原B孔的斑點數(shù))-(陰性對照孔斑點數(shù))≥6，或者陰性對照孔斑點數(shù)為6-10個時(抗原A或抗原B孔的斑點數(shù))≥2×(陰性對照孔斑點數(shù))為陽性結果，不符合上述陽性結果且陽性對照孔正常則為陰性結果。

涂片抗酸染色 ：在顯微鏡下觀察每100個視野有≥3條抗酸桿菌即為陽性結果。

紅細胞沉降率 ：男性15～49歲>15mm/h，50～85歲>20mm/h，86～110歲>30mm/h為紅細胞沉降率加快；女性15～49歲>20mm/h，50～85歲>30mm/h，86～110歲>45mm/h為紅細胞沉降率加快。

4.5 統(tǒng)計學方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件，收集資料為計數(shù)資料，多個樣本率的比較采用χ2檢驗，對于2個單元格的期望計數(shù)小于5，使用Fisher的精確檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。對于計量資料的正態(tài)性檢驗采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗分析，對兩獨立樣本的數(shù)據(jù)差異分析使用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗。

結 果

1 160例結核病患者T-STOP.TB試驗陽性146例、敏感度91.3%；紅細胞沉降率檢測陽性101例、敏感度63.1%；涂片抗酸染色陽性67例、敏感度41.9%。T-STOP.TB敏感度高于紅細胞沉降率檢測與涂片抗酸染色，且差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=35.94，χ2=87.63，P<0.05)，見表1。

表1 160例結核病患者T-STOP.TB、紅細胞沉降率、抗酸染色敏感度

注:﹡T-STOP.TB VS 紅細胞沉降率；﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色

2 46例非結核病患者T-STOP.TB試驗44例陰性、特異度95.7%；紅細胞沉降率檢測22例陰性、特異度47.8%；涂片抗酸染色46例、特異度100.0%。T-STOP.TB試驗特異度高于紅細胞沉降率，且差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.95，P<0.05)；T-STOP.TB試驗特異度與抗酸染色相當，差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.495)，見表2。

3 T-STOP.TB試驗、紅細胞沉降率檢測、涂片抗酸染色結果的陽性預測值分別為98.6%，80.8%，100%。T-STOP.TB試驗的陽性預測值高于紅細胞沉降率，且差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.05，P<0.05)；T-STOP.TB試驗的陽性預測值與抗酸染色相當，差異沒有統(tǒng)計學意義(P=1.0)，見表3。

4 T-STOP.TB試驗、紅細胞沉降率檢測、涂片抗酸染色結果的陰性預測值分別為75.9%，27.2%，33.1%，T-STOP.TB試驗的陰性預測值均高于紅細胞沉降率與抗酸染色，且差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=32.15，χ2=30.17，P<0.05)，見表4。

表2 46例結核病患者T-STOP.TB、紅細胞沉降率、抗酸染色特異度

注:﹡T-STOP.TB VS 紅細胞沉降率,﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色﹟2個單元格的期望計數(shù)小于5，使用Fisher的精確檢驗

表3 T-STOP.TB、紅細胞沉降率、抗酸染色陽性預測值

注:﹡T-STOP.TB VS 紅細胞沉降率,﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色,﹟2個單元格的期望計數(shù)小于5，使用Fisher的精確檢驗

表4 T-STOP.TB、紅細胞沉降率、抗酸染色陰性預測值

注:*T-STOP.TB VS 紅細胞沉降率,﹟T-STOP.TB VS 抗酸染色

5 分析結核組與對照組T-SPOT.TB實驗ESAT-6與CFP-10兩種抗原斑點數(shù)分布情況，采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗分析結核組兩種抗原斑點數(shù)的正態(tài)性分別為Z=0.216，P=0.000；Z=0.403，P=0.00認為結核組兩種抗原斑點數(shù)均為非正態(tài)分布。結核組ESAT-6抗原的斑點數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距為43.00±69.75, 對照組ESAT-6抗原的斑點數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距3.50±9.00；結核組 CFP-10抗原的斑點數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距為56.00±87.50；對照組CFP-10抗原的斑點數(shù)中位數(shù)±四分位數(shù)間距3.00±9.00。采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗Mann-Whitney U分析兩種抗原診斷結核的差異性，結果顯示結核組T-SPOT.TB實驗兩種抗原陽性斑點數(shù)目均高于對照組(圖1)，且差異具有統(tǒng)計學意義(Z=-14.258，Z=-13.620，P=0.00)。

注:結核組與對照組比較，* P<0.05

6 上述結果可見，結核組兩種抗原斑點數(shù)均為非正態(tài)分布，利用(P2.5,P97.5)計算其95%可信區(qū)間，結核組ESAT-6抗原的斑點數(shù)95%可信區(qū)間(4.03,400.00)；CFP-10抗原的斑點數(shù)95%可信區(qū)間(4.03,500)。根據(jù)受試者工作特征曲線(ROC 曲線)，ESAT-6抗原的斑點數(shù)cut-off值取17.5時，ROC曲線下面積為0.960(高于0.9)，診斷結核的靈敏度和特異度分別可達到 81.9%和 98.7%(圖2A)；CFP-10抗原的斑點數(shù)cut-off值取19.0時，ROC曲線下面積為0.960(高于0.9)，診斷結核的靈敏度和特異度分別可達到76.9%和 98.7%(圖2B)。

圖2 結核組T-SPOT.TB兩種抗原斑點數(shù)ROC曲線

討 論

近年來我國結核病疫情出現(xiàn)回升趨勢，結核病防治形勢嚴峻，任務緊迫，實驗室的檢驗早期發(fā)現(xiàn)和準確診斷是降低結核病發(fā)病率、減少傳播機會、控制結核病疫情的關鍵環(huán)節(jié)[9]。目前，臨床診斷結核病的實驗室檢查方法比較多，但都并不理想，容易造成結核病的誤診及漏診。

結核病是由結核桿菌感染引起的慢性傳染病。結核菌可能侵入人體全身各種器官，潛伏期4～8周。其中73%以上發(fā)生在肺部[10]，其他部位如頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼等也可繼發(fā)感染。故涂片抗酸染色雖然操作簡單、診斷快速、費用低廉，但檢測結果受技術人員水平的影響，檢測率低，且無法對肺外結核作出診斷[11]，故敏感度低。

患者感染結核菌時結核病變呈活動性時,血中纖維蛋白原及球蛋白含量增加,紅細胞沉降率會明顯增快，但紅細胞沉降率受影響因素較多，生理性如月經、妊娠、高齡以及增多的纖維蛋白原；病理性的有炎癥、組織損傷、壞死、惡性腫瘤、高球蛋白血癥、貧血、高膽固醇血癥等，都能使紅細胞沉降率變快。有文獻報道41%活動性結核性胸膜炎血沉正常[12]，而其特異度較差。

人與人之間呼吸道傳播是本病傳染的主要方式，傳染源是排菌的肺結核患者。隨著環(huán)境污染和艾滋病的傳播，結核病發(fā)病率越發(fā)強烈。除少數(shù)發(fā)病急促外，臨床上多呈慢性過程，常有低熱、乏力等全身癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統(tǒng)表現(xiàn)[13]。結核菌感染的免疫反應主要是細胞介導的免疫反應，作為細胞介導反應的一部分，T淋巴細胞被結核菌抗原致敏，這些抗原再次刺激時，活化的效應T淋巴細胞，主要CD4、部分CD8細胞產生γ干擾素[14]。結核特異性T細胞檢測實驗將結核特異性抗原(ESAT-6/CFP-10)與外周血單個核細胞孵育，通過“雙抗夾心法”檢測釋放的γ-干擾素，從而檢測結核致敏的效應T淋巴細胞，判斷患者是否存在結核感染，且T-SPOT.TB的T細胞定量應答反應可反映結核抗原負荷和疾病的活動性,隨著活動性肺結核的有效治療, 定量應答反應下降[15]。

本研究結果顯示，T-SPOT.TB試驗的敏感度、特異度、陽性預測值及陰性預測值均優(yōu)于紅細胞沉降率；T-SPOT.TB試驗檢測的敏感度及陰性預測值優(yōu)于抗酸染色，特異度與陽性預測值與抗酸染色相當。且目前的報道都肯定了T-SPOT.TB試驗的特異度和靈敏度[16]。進一步證實了T-SPOT.TB試驗對結核病患者有較好的診斷價值。在差異性分析中， T-SPOT.TB試驗無論是ESAT-6抗原還是CFP-10抗原都在結核組與對照組中有顯著差異，對于結核病的診斷有極其重要的意義。此外，在ROC曲線分析中我們發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB試驗中ESAT-6抗原與CFP-10抗原對于診斷結核都有很好的敏感度和特異度，但CFP-10抗原相比ESAT-6抗原的敏感度稍差，在臨床上要結合兩種抗原結果綜合診斷。值得注意的是，在經過抗結核治療后的患者，其效應T淋巴細胞數(shù)目減少[15]，可造成假陰性結果，部分正常人或者非結核病患者接觸結核病患者可能發(fā)生潛伏感染而導致假陽性，故需要結合臨床來判斷。

綜上所述，常用的結核病實驗室的診斷方法難以滿足臨床早期準確診斷結核病的需要,但T-SPOT.TB檢測方法以ESAT-6和CFP-10為結核特異性蛋白抗原，能夠快速、準確的診斷結核病感染,對于控制傳染源,降低感染率具有重要社會意義和流行病學意義,對于減少結核病額誤診漏診率,提高結核感染診斷率和治愈率具有重要臨床意義。

[1] Wallis RS, Maeurer M, Mwaba P,etal. Tuberculosis--advances in development of new drugs, treatment regimens, host-directed therapies[J].Lancet Infect Dis, 2016, 16: e34-46.

[2] 全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組. 2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告[J]. 中國防癆雜志,2002,(2):43-46.

[3] 杜森榮,侯秀英. 結核感染T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗對結核診斷價值的Meta分析[J]. 中國臨床研究,2014,(5):526-529.

[4] 陸建紅,陳國軍,杜開齊,等. 結核T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗診斷結核感染的臨床應用[J]. 武警醫(yī)學,2013,24(10):866-868，871.

[5] Getnet F, Demissie M, Assefa N ，etal. Delay in diagnosis of pulmonary tuberculosis in low-and middle-income settings: systematic review and meta-analysis[J]. BMC Pulm Med ，2017，17: 202.

[6] Assael R, Cervantes J, Barrera G. Smears and cultures for diagnosis of pulmonary tuberculosis in an asymptomatic immigrant population[J]. Int J Gen Med ，2013， 6: 777-779.

[7] Rangaka MX, Cavalcante SC, Marais BJ，etal. Controlling the seedbeds of tuberculosis: diagnosis and treatment of tuberculosis infection[J]. Lancet， 2015， 386: 2344-2353.

[8] Perez-Camacho I, Rivero-Juarez A, Kindelan JM,etal. Present-day treatment of tuberculosis and latent tuberculosis infection[J]. Enferm Infecc Microbiol Clin, 2011,29(Suppl 1): 41-46.

[9] 儲新民,孔建新. 酶聯(lián)免疫斑點試驗診斷結核的敏感性和特異性研究[J]. 安徽醫(yī)科大學學報,2012,47(5):613-615.

[10] Karadakhy K, Othman N, Ibrahimm F,etal. Tuberculosis in sulaimaniyah, iraqi kurdistan: A detailed analysis of cases registered in treatment centers[J]. Tanaffos, 2016,15: 197-204.

[11] 唐碩潤,梁 珍. 結核酶聯(lián)免疫斑點試驗、結核分枝桿菌DNA測定和痰涂片檢測在肺結核診斷中的比較研究[J]. 中國當代醫(yī)藥,2013,20(34):122-123.

[12] 鄭曉靜,孫鳳艷,陳 敏,等. 結核性胸膜炎積液與血沉的關系[J]. 臨床肺科雜志,2005,10(1):84.

[13] Grimaud-Ayina M, Fain O, Lortholary O，etal. Neuromeningeal tuberculosis in northeastern suburbs of paris. nineteen cases[J]. Ann Med Interne (Paris)， 2002，153: 75-81.

[14] Sauzullo I, Scrivo R, Mengoni F，etal. Multi-functional flow cytometry analysis of CD4+T cells as an immune biomarker for latent tuberculosis status in patients treated with tumour necrosis factor (TNF) antagonists[J]. Clin Exp Immunol ，2014，176: 410-417.

[15] Lancioni CL, Mahan CS, Johnson DF,etal. Effects of antiretroviral therapy on immune function of HIV-infected adults with pulmonary tuberculosis and CD4+>350 cells/mm3[J]. J Infect Dis， 2011， 203: 992-1001.

[16] 楊國平,葉敏霞,楊啟生,等. γ-干擾素釋放試驗用于出入境人群結核病診斷的研究[J]. 國際檢驗醫(yī)學雜志,2017,38(1):27-28，31.