UPLC-MS/QAMS測(cè)定小鼠血漿中石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的濃度Δ

魯艷柳，黃思，劉浩，曾瑤，王建秋，徐亞沙，陸遠(yuǎn)富，何芋岐（遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563003）

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）為蘭科石斛屬（DendrodiumSW.）植物，是《中國藥典》明確規(guī)定的藥用石斛的植物來源，又名扁金釵、扁黃草、扁草、黃草等[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品，素有“千金草”之稱[2]，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳、明目強(qiáng)身等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金釵石斛總生物堿是金釵石斛的主要活性成分，具有止痛、解熱作用，可以降低心率、血壓，減慢呼吸，并且緩解巴比妥引起的中毒癥狀[3]，還具有降血糖[4]、抗白內(nèi)障[5]、抗腫瘤[6]、減少細(xì)胞凋亡[7]、抗氧化[8]和抗老年癡呆[9]等作用。而石斛堿（Dendrobine）是金釵石斛總生物堿中最主要的特征性成分[1，3]，開發(fā)應(yīng)用前景廣闊。本課題組前期鑒定出石斛堿在人肝微粒體中的主要代謝產(chǎn)物有M-250、M-280[10]，本文在此基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜/一測(cè)多評(píng)法（UPLC-MS/QAMS），首次建立了測(cè)定小鼠血漿中石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280濃度的方法，為進(jìn)一步研究石斛堿的藥動(dòng)學(xué)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的結(jié)構(gòu)圖見圖1。

圖1 石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Structures diagrams of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific Q Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨MS系統(tǒng)和Thermo Ultrmate 3000 UPLC系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）；Genius 1022液氮發(fā)生器（英國Peak公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；XS205電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；XW-80A漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Microfuge 20R高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter有限公司）。

1.2 藥品與試劑

石斛堿對(duì)照品（北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：D990100，純度：≥99.0%）；鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：171237-201208，純度：≥99.9%）；乙腈、甲醇、甲酸均為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康SPF級(jí)C57BL/6J小鼠24只，♂，體質(zhì)量18～22 g，由重慶第三軍醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（渝）2012-0005，飼養(yǎng)溫度 21～22℃，濕度56%～65%，明暗交替時(shí)間12/12 h。本實(shí)驗(yàn)符合遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組，每組12只，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。根據(jù)本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果，給藥組小鼠按60 mg/kg灌胃石斛堿[以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液助懸]，空白對(duì)照組小鼠灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液，1 h后，眼眶取血0.2 mL至肝素化的離心管中，1 856×g離心15 min，分離血漿待測(cè)。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取石斛堿對(duì)照品15.52 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度，混勻，即得對(duì)照品貯備液，于4℃保存，備用。使用前以乙腈稀釋，得到含石斛堿質(zhì)量濃度分別為51.73、15.52、7.76、1.55、0.78、0.16μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品10.01mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度線，混勻，即得內(nèi)標(biāo)貯備液，于4℃保存，備用。使用前以乙腈稀釋，得到含鹽酸偽麻黃堿質(zhì)量濃度為0.4μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的制備

分別取100μL空白血漿，加入不同質(zhì)量濃度的石斛堿對(duì)照品溶液20μL，渦旋30 s，再依次加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL和乙腈200 μL，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液，即得含石斛堿質(zhì)量濃度分別為912.94、456.47、91.29、45.65、9.13、3.04、0.91 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。其中，質(zhì)量濃度為912.94、91.29、9.13 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品為高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，均平行制備5份。

2.4 血漿樣品的處理

取100μL血漿樣品，加入乙腈20μL，渦旋30 s，再依次加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL和乙腈200μL，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液50 μL，進(jìn)樣分析。

2.5 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.5.1色譜條件色譜柱：Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min，5%B；0.5～15 min，5%→95%B；15～17 min，95%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.5.2 MS條件 采用可加熱電噴霧離子源（HESI）的離子化方式；霧化溫度：300℃；離子傳輸管溫度：350℃；鞘氣流速：35 arb；輔助氣流速：15 arb；噴霧電壓：3.5 kV；碰撞電壓：30、40、50 eV；質(zhì)荷比（m/z）檢測(cè)范圍：100～1 500；掃描模式：全掃描/正離子模式；全掃描模式下分辨率：70 000 FWHM。

2.6 專屬性考察

取100μL空白血漿，加入200μL乙腈，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液即得空白血漿樣品。取空白血漿樣品、標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品和按“2.4”項(xiàng)下方法處理得到的血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，石斛堿（[M+H]+m/z264.195 9）及其代謝產(chǎn)物M-250（[M+H]+m/z250.180 1）、M-280（[M+H]+m/z280.190 6）的保留時(shí)間分別為7.76、7.73、8.11 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的測(cè)定。石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的選擇離子圖見圖2。

2.7 線性關(guān)系、定量下限和檢測(cè)限考察

取“2.3”項(xiàng)下對(duì)應(yīng)樣品進(jìn)樣測(cè)定后，采用加權(quán)（1/X2）最小二乘法，以石斛堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），石斛堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y＝－10－5x2+0.043 2x+0.430 9（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，石斛堿檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為9.13～912.94 ng/mL，定量下限為3.04 ng/mL，檢測(cè)限為0.91ng/mL。

2.8 基質(zhì)效應(yīng)考察

取“2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，進(jìn)樣測(cè)定，記錄石斛堿和內(nèi)標(biāo)峰面積，分別記為A1和B1。將空白血漿換為水，同法制備高、中、低質(zhì)量濃度的石斛堿+內(nèi)標(biāo)溶液，均平行制備5份，進(jìn)樣測(cè)定，記錄石斛堿和內(nèi)標(biāo)峰面積，分別記為A2和B2。按A1/A2×100%計(jì)算石斛堿的基質(zhì)效應(yīng)，B1/B2×100%計(jì)算內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表1。

表1 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果（n＝5）Tab 1Results of matrix effect（n＝5）

2.9 精密度和準(zhǔn)確度考察

取“2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，分別連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，分別考察15℃保存24 h，－70℃保存并反復(fù)凍融3次，以及－70℃保存15 d后樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。

圖2 石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的選擇離子圖Fig 2 Selected ion chromatogram of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

2.11 血漿樣品中石斛堿的濃度

按“2.4”項(xiàng)下方法處理給藥組小鼠的血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算血漿樣品中石斛堿的質(zhì)量濃度為（41.3±5.7）ng/mL（n＝12）。

表2 精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果Tab 2 Results of precision and accuracy tests

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果（n＝3）Tab 3Results of stability tests（n＝3）

2.12 一測(cè)多評(píng)法計(jì)算血漿樣品中石斛堿代謝產(chǎn)物M-250、M-280的濃度

按一測(cè)多評(píng)法，取“2.11”項(xiàng)下給藥組小鼠的血漿樣品，以石斛堿對(duì)照品為對(duì)照，按“2.5”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，按Wk＝fs/k×[（Ws×Ak）/As]計(jì)算其代謝產(chǎn)物 M-250、M-280的濃度。式中，Wk為待測(cè)物質(zhì)量濃度；fs/k為相對(duì)校正因子，此處為1.0；Ws為石斛堿對(duì)照品質(zhì)量濃度；As為石斛堿對(duì)照品峰面積；Ak為待測(cè)物峰面積。結(jié)果顯示，血漿樣品中石斛堿代謝產(chǎn)物M-250、M-280的質(zhì)量濃度分別為（493.0±73.1）、（41.4±3.0）ng/mL（n＝12）。

3 討論

在本課題組前期研究中，通過精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)碎片離子信息，鑒定了石斛堿在人肝微粒體中Ⅰ相代謝的4個(gè)主要代謝產(chǎn)物M-250、M-262、M-280和M-296，以及Ⅱ相代謝的1個(gè)主要代謝產(chǎn)物M-440[10]。本文檢測(cè)了小鼠灌胃石斛堿后，血漿中石斛堿及其主要代謝產(chǎn)物M-250、M-280的濃度。但獲得石斛堿代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品，以及對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量還存在比較大的困難。因此，本研究借鑒了天然藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)中的一測(cè)多評(píng)法，以其進(jìn)行兩種主要代謝產(chǎn)物M-250、M-280的定量研究。

一測(cè)多評(píng)法對(duì)于對(duì)照品難以得到的多指標(biāo)測(cè)定有其特殊的優(yōu)勢(shì)[11]，目前在天然藥物及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用已較成熟，如《美國藥典》34版中有25個(gè)天然藥物及制劑、《歐洲藥典》7.0版中有9個(gè)天然藥物、2015年版《中國藥典》（一部）中黃連及銀杏葉提取物等的質(zhì)量評(píng)價(jià)均采用該方法[12]。在多指標(biāo)檢測(cè)中，以某一組分的對(duì)照品為對(duì)照，建立與其他待測(cè)組分之間的fs/k（即RCF），計(jì)算其他組分的含量，公式為：fs/k＝（Wk×As）/（Ws×Ak）。式中，Wk為待測(cè)物質(zhì)量濃度；As為對(duì)照品峰面積；Ws為對(duì)照品質(zhì)量濃度；Ak為待測(cè)物峰面積。

結(jié)構(gòu)類型相同的化合物，RCF的值往往接近1，如2015年版《中國藥典》（一部）中黃連藥材各生物堿的RCF值均為1.0，可直接以鹽酸小檗堿對(duì)照品的峰面積為對(duì)照，分別計(jì)算小檗堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的含量?？紤]到石斛堿代謝產(chǎn)物M-250、M-280的結(jié)構(gòu)與石斛堿十分相似，如圖1，故暫定這兩個(gè)代謝產(chǎn)物的RCF值均為1.0，并以峰面積相當(dāng)?shù)氖鷫A對(duì)照品質(zhì)量濃度進(jìn)行計(jì)算。但上述推測(cè)還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，本研究建立了一種靈敏、準(zhǔn)確，可用于小鼠血漿中石斛堿及其代謝產(chǎn)物M-250、M-280的濃度測(cè)定的方法，為研究石斛堿的藥動(dòng)學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

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