注射用黃芪多糖單糖鑒別及游離單糖檢查方法研究

王 趙 ，趙劍鋒 ，王 瑩 ，張建寶 ，金紅宇 ，馬雙成 △

（1．中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050； 2．國(guó)家藥典委員會(huì)，北京 100061；3．天津賽諾制藥有限公司，天津 301700）

注射用黃芪多糖為腫瘤輔助用藥，功能益氣補(bǔ)虛，用于倦怠乏力，少氣懶言，自汗、氣短、食欲不振，屬氣虛證因化學(xué)治療后白細(xì)胞減少，生活質(zhì)量降低，免疫功能低下的腫瘤患者[1]。注射用黃芪多糖是利用現(xiàn)代分離技術(shù)提取分離黃芪中的多糖有效部位，并純化精制而成。注射用黃芪多糖由天津賽諾制藥有限公司生產(chǎn)，于2001年取得新藥證書(shū)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為WS－330（Z－030）－2001（試行），其中前處理過(guò)程需使用高毒試劑（碳酸鋇與硫酸溶液反應(yīng)產(chǎn)生Ba2＋），此外，紙色譜目前已較少使用，且3種單糖分離效果不明顯。基于以上不足，本研究中對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“單糖鑒別”“游離單糖檢查”項(xiàng)[2]進(jìn)行了深入探討，改進(jìn)樣品前處理方法，采用硅膠G板優(yōu)化分離條件，建立了注射用黃芪多糖水解產(chǎn)物的鑒別方法及注射用黃芪多糖中游離單糖的檢查方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Linomat－Ⅳ型薄層自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士CAMAG公司)；Visualizer型薄層色譜照相系統(tǒng)型，包括VinCAYTS薄層色譜軟件(瑞士CAMAG公司)；KQ－30012D型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司)；AE－240型分析天平(萬(wàn)分之一，Metter公司)；P－1型雙槽展開(kāi)缸（200 mm×100 mm）；3030－861型硅膠 G 板(20 cm×20 cm，德國(guó)默克公司)，3030－861型微晶纖維素板（20 cm ×20 cm， whatmanTM），紙薄層板(型號(hào)不詳)。葡萄糖對(duì)照品（Glu，批號(hào)為 110833－201205，含量為99．5% ），半乳糖對(duì)照品（Gal，批號(hào)為 100226 － 201105，含量為99．9%），半乳糖醛酸對(duì)照品（批號(hào)為111646－200301，純度大于98%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；阿拉伯糖對(duì)照品（Ara，批號(hào)為 C10297500，含量為 99．0% ），鼠李糖 對(duì)照 品（Rha，C16813500，含 量為98．3%），均購(gòu)自 Dr．EhrenstoferGmbH；注射用黃芪多糖（批號(hào)為 150702，151201，151101，M150701，M151001，天津賽諾制藥有限公司）；所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 單糖鑒別

2．1．1 現(xiàn)行方法[3]

鑒別：取本品 0．2 g，加 1 moL ／L 硫酸溶液 25 mL，置水浴中水解 7 h，取出，放冷，取 5 mL，加碳酸鋇（固體）中和至中性，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取葡萄糖和阿拉伯糖對(duì)照品，分別加水制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照紙色譜法試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一新華中速層析濾紙上，以醋酸乙酯－甲酸－水（6∶2∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以苯胺－鄰苯二甲酸溶液（取苯胺0．93 g和鄰苯二甲酸1．66 g，溶于水飽和正丁醇100 mL中），在105℃烘約5 min。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。紙色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 紙色譜圖

檢查：取本品，加水制成每1 mL含20 mg的溶液，作為供試品溶液。另取葡萄糖和阿拉伯糖對(duì)照品，分別加水制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照2000年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液 10 μL，對(duì)照品溶液各 2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－0．1 moL／L磷酸二氫鈉溶液－丙酮（4∶1∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以 α－萘酚試液，在 90～100℃烘約 5 min。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，未顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2．1．2 改進(jìn)方法

鑒別：取黃芪多糖20 mg，加水5 mL使溶解。取1 mL，加 6 mol／L 三氟乙酸（TFA）1 mL，密封，于 110 ℃反應(yīng)6 h；氮?dú)獯蹈桑蛹状技s1 mL，吹干，再重復(fù)操作1次，以除盡剩余的TFA，殘?jiān)铀?．5 mL溶解，作為供試品溶液。另取葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖適量，加水制成每1 mL分別含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（2015年版《中國(guó)藥典＜四部＞》通則 0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液 5 μL、對(duì)照品溶液 1 ～5 μL，分別點(diǎn)于同一Merck硅膠G60薄層板上，以正丁醇－乙酸乙酯 －異丙醇 －乙酸 －吡啶 －水（7∶20∶12∶7∶6∶5）為展開(kāi)劑，二次展開(kāi)，展距9 cm，取出，晾干，噴以苯胺－鄰苯二甲酸溶液（取苯胺0．93 g和鄰苯二甲酸1．66 g，溶于水飽和正丁醇100 mL中），在105℃烘約5 min，置紫外光燈（365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 薄層色譜圖

檢查：取本品20 mg，加水1 mL使溶解，作為供試品溶液。照鑒別方法試驗(yàn)。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上未顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2．1．3 方法學(xué)考察

薄層板考察：首先考察纖維素板的分離效果[5]，結(jié)果單糖斑點(diǎn)較大，產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，各單糖分離效果不明顯，詳見(jiàn)圖3。比較硅膠H板與硅膠G板的差異，發(fā)現(xiàn)硅膠H板因不含黏合劑，在展開(kāi)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)吸附薄層脫落的現(xiàn)象，且分離效果不好，硅膠G板效果較好，且硅膠略帶酸性，適于分離酸性及中性物質(zhì)，目前應(yīng)用廣泛，便于實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備耗材。最終選擇硅膠G板。

圖3 微晶纖維素薄層色譜圖

展開(kāi)系統(tǒng)考察：參考文獻(xiàn)[6－9]，考察了不同展開(kāi)劑系統(tǒng)(Ⅰ～Ⅳ)的分離效果，系統(tǒng)Ⅰ正丁醇－0．1 mol／L磷酸二氫鈉溶液－丙酮（4∶1∶5）、系統(tǒng)Ⅱ正丁醇－丙酮－水（5∶1∶1）、系統(tǒng)Ⅲ正丁醇 －乙酸乙酯 －水（7∶2∶1）、系統(tǒng)Ⅳ正丁醇－醋酸乙酯－異丙醇－乙酸－吡啶－水（7∶20∶12∶7∶6∶5）；同時(shí)，采用展開(kāi)劑系統(tǒng)Ⅳ二次展開(kāi)。結(jié)果展開(kāi)劑系統(tǒng)Ⅰ展開(kāi)，單糖斑點(diǎn)較大，有拖尾現(xiàn)象；展開(kāi)劑系統(tǒng)Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ展開(kāi)，單糖斑點(diǎn)較好，但水解黃芪多糖樣品分離不完全。最終選擇了使用展開(kāi)劑系統(tǒng)Ⅳ（正丁醇－醋酸乙酯－異丙醇 －乙酸 －吡啶 －水 ＝7∶20∶12∶7∶6∶5）二次展開(kāi)作為修訂標(biāo)準(zhǔn)的展開(kāi)系統(tǒng)。薄層色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 展開(kāi)系統(tǒng)薄層色譜圖

顯色劑考察[8－10]：考察苯胺－鄰苯二甲酸顯色劑在日光、366 nm熒光、茴香醛及α－萘酚顯色劑的顯色效果，以展開(kāi)劑系統(tǒng)Ⅳ作為展開(kāi)劑及展開(kāi)方法，點(diǎn)樣量分別為 10，10，10，5，2，10 μL。結(jié)果見(jiàn)圖 4 E 和圖 5。最終確定使用苯胺－鄰苯二甲酸顯色劑(366 nm熒光下)檢視。

圖5 展示系統(tǒng)二次展開(kāi)顯色劑薄層色譜圖

展開(kāi)溫度和濕度考察：考察薄層板展開(kāi)過(guò)程中溫度和相對(duì)濕度對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果表明，溫度為10，20，30℃時(shí)，各指標(biāo)成分斑點(diǎn)的 Rf值影響不大，對(duì)分離效果幾乎無(wú)影響；相對(duì)濕度為30%，50%，75%時(shí)，各指標(biāo)成分斑點(diǎn)的 Rf值影響不大，對(duì)分離效果也幾乎無(wú)影響。

點(diǎn)樣量考察：經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，減少點(diǎn)樣量有利于提高分離效果，建議點(diǎn)樣量固定為“供試品溶液5 μL，對(duì)照品溶液 1 ～5 μL”。

2．2 游離單糖檢查

2．2．1 色譜條件[4－11]與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Spolar C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 －0．1 mol／L 乙酸銨（體積比為 21 ∶79，加冰醋酸調(diào)節(jié) pH 為 5．5）；流速：1．0 mL ／min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量：10 μL。水解后黃芪多糖樣品中出現(xiàn)5個(gè)單糖的色譜峰，以葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖色譜峰為主，未水解黃芪多糖樣品中未出現(xiàn)單糖色譜峰。色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 高效液相色譜圖

2．2．2 溶液制備

分別精密稱取鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖適量，配制成適宜濃度的混合對(duì)照品溶液。定量吸取上述溶液 500 μL，加 0．3 mol／L 氫氧化鈉溶液 67 μL，再加入 0．5 mol／L PMP 甲醇溶液 150 μL，攪拌均勻，于 70 ℃反應(yīng) 90 min。冷卻至室溫，加 0．3 mol／L鹽酸溶液67 μL中和。加1 mL氯仿萃取，分去下層有機(jī)層，重復(fù)萃取3次，取上層溶液，作為對(duì)照品溶液。

取黃芪多糖樣品約20 mg，精密稱定，加水制成每1 mL約含4．0 mg的溶液，定量吸取250 μL，置安瓿中，加入等體積的6 mol／L三氟乙酸，密閉，于110℃反應(yīng)6 h。氮?dú)獯蹈?，加適量甲醇，再吹干，重復(fù)3次，以除盡剩余三氟乙酸。加水500 μL，使殘?jiān)芙?。照?duì)照品溶液制備“加 0．3 mol／L 氫氧化鈉溶液 67 μL”起同法處理，取上層溶液，作為供試品溶液1。另取黃芪多糖，加水制成每1 mL含1 mg的溶液，定量吸取500 μL，照對(duì)照品溶液制備“加 0．3 mol／L 氫氧化鈉溶液 67 μL”起同法處理，取上層溶液，作為供試品溶液2。

2．2．3 方法學(xué)考察

日間精密度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為151101），按不同日期依法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，日間精密度 RSD偏大，重復(fù)性差，建議僅用作定性鑒別。

表1 日間精密度試驗(yàn)結(jié)果（%，n＝6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為151101），精密稱取20 mg，于 0，1，2，6，12，24，36 h 時(shí)依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表 2。其中，半乳糖 RSD偏大，但符合鑒別方法要求，表明葡萄糖和阿拉伯糖在36 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為151101）適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝7）

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3 討論

通過(guò)對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“單糖鑒別”“游離單糖檢查”項(xiàng)進(jìn)行研究，改進(jìn)了樣品前處理方法，避免出現(xiàn)高毒離子(Ba2＋)，此外，通過(guò)采用實(shí)驗(yàn)室常用的硅膠G板分離黃芪多糖水解產(chǎn)物，優(yōu)化了分離條件，使單糖分離效果明顯。將原標(biāo)準(zhǔn)中檢查項(xiàng)下“游離單糖”的檢查與此薄層鑒別方法合并，同時(shí)進(jìn)行單糖鑒別和游離單糖的檢查，大大提高了工作效率，減少了試劑的使用。

對(duì)混合單糖進(jìn)行分離比較困難，尤其是葡萄糖和阿拉伯糖在硅膠板上的分離。本研究中對(duì)多種薄層色譜條件進(jìn)行了考察，對(duì)于其他單糖的薄層鑒別具有參考價(jià)值。

本研究中采用高效液相色譜法對(duì)注射用黃芪多糖的單糖組成進(jìn)行了初步研究，先將注射用黃芪多糖用三氟乙酸水解，然后進(jìn)行PMP衍生化處理，紫外吸收后進(jìn)行高效液相色譜數(shù)據(jù)采集，色譜峰峰形較好，5種單糖分離完全。故可用于注射用黃芪多糖中單糖組成的鑒別及游離單糖的檢查。

高效液相色譜法方法學(xué)考察結(jié)果顯示，葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖回收率及穩(wěn)定性結(jié)果基本符合定量測(cè)定要求，但日間精密度 RSD值偏大，重復(fù)性差，建議僅作定性鑒別使用。

薄層色譜方法是中藥鑒別常用方法之一，其簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)在中藥質(zhì)量控制中有著不可替代的地位，由于紙色譜目前已逐漸被其他方法取代，本研究將硅膠G板薄層鑒別替代紙色譜鑒別用于黃芪多糖注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中單糖的研究，并建立了黃芪多糖的高效液相色譜鑒別和檢查方法，安全、準(zhǔn)確，可用于注射用黃芪多糖的質(zhì)量控制。

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