葡萄糖注射液中注射用血栓通與胰島素配伍穩(wěn)定性考察*

彭 雯 ，王耀華 ，孫志強(qiáng) ，孫冬曉 ，賈聚坤 ，孟 巖 ，任曉華

（1．河北省石家莊市第一醫(yī)院，河北 石家莊 050011； 2．河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 050017）

注射用血栓通是從中藥三七中提取有效活性成分制成的一種純中藥制劑，主要成分為三七總皂苷，具有活血祛瘀、通脈活絡(luò)的功效，主要用于治療中風(fēng)偏癱、瘀血阻絡(luò)及腦血管疾病后遺癥、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞屬瘀血阻滯證[1]，廣泛用于心腦血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等[2]。其藥品說(shuō)明書(shū)規(guī)定：本品應(yīng)以10%葡萄糖注射液250～500 mL稀釋后緩慢靜脈滴注，1日1次。臨床部分患者會(huì)同時(shí)患有糖尿病，因此需要在注射用血栓通與葡萄糖配伍溶液中加入胰島素，以防糖耐量異?；蜓巧?。此方法為臨床經(jīng)驗(yàn)性配伍用藥，其安全性無(wú)確切依據(jù)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。本研究中考察了注射用血栓通與胰島素在葡萄糖注射液中的配伍穩(wěn)定性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1．1 儀器

LC－10ATVP型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV－1901型雙光束紫外分光光度計(jì)（普析通用，檢測(cè)精度為2%）；DELTA320型 pH計(jì)(梅特勒－托利多儀器有限公司，檢測(cè)精度為0．1)；GWF－5J型微粒分析儀(天津天河醫(yī)療儀器有限公司)。

1．2 試藥

注射用血栓通(廣西梧州制藥股份有限公司，批號(hào)為20160107，規(guī)格為每支250 mg)；胰島素注射液(江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為1601103，規(guī)格為每支10 mL∶400 U)，10%葡萄糖注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為1602025，規(guī)格為每瓶250 mL)；胰島素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為7337865，規(guī)格為2 mg)；三七總皂苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為150720－201509，規(guī)格為20 mg）；甲醇（Fisher公司，4 L，色譜純），乙腈（Fisher公司，4 L，色譜純）；水（屈臣氏蒸餾水，批號(hào)為 20160201）；磷酸（H3PO4，批號(hào)為 79622 － 500 g），無(wú)水硫酸鈉（Na2SO4，批號(hào)為 239313－500 g），均購(gòu)自 Sigma公司，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 三七總皂苷含量測(cè)定方法的建立[3－5]

2．1．1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

精密稱取三七總皂苷，加乙醇溶解，稀釋至0．1 g／L，乙醇為空白對(duì)照，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。檢測(cè)到三七總皂苷在317 nm波長(zhǎng)處有較大吸收。重復(fù)實(shí)驗(yàn)并參考文獻(xiàn)[5－7]，確定317 nm為三七總皂苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2．1．2 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱取0．016 0 g，置100 mL容量瓶中，加乙醇超聲溶解定容，得質(zhì)量濃度為0．16 g／L的貯備液，精密量取該貯備液1，2，4，8，10 mL，分別置 5 個(gè) 100 mL 容量瓶中，并加乙醇定容，超聲充分溶解，制得不同質(zhì)量濃度的溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝4．357×10－3X＋9．216×10－3，r＝0．999 9。結(jié)果三七總皂苷質(zhì)量濃度在 1．6 ～ 16．0 μg／mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系考察項(xiàng)下 6．4 μg／mL的供試品適量，依法制備供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果的RSD為1．21%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下的供試品溶液，分別于 0，1，2，4，6，8，12 h 時(shí)測(cè)定吸光度值。結(jié)果的 RSD 為1．08%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批三七總皂苷對(duì)照品，按線性關(guān)系項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，分別精密吸取1．6 μg／mL進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果三七總皂苷的RSD為1．31%(n＝5)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品(批號(hào)為20160107)，精密稱定6份，每份約1 mg，分別加入一定量的三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL容量瓶中，加乙醇搖勻，充分溶解后定容。測(cè)定其吸光度值，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 三七總皂苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2．1．3 干擾試驗(yàn)

模擬臨床用藥，取樣品250 mg溶于10%葡萄糖注射液500 mL中，并加入8 U胰島素作為供試品；取樣品250 mg溶于500 mL乙醇作為空白對(duì)照，分別均勻混合后測(cè)定其吸光度值，平行測(cè)定3次，結(jié)果無(wú)差異。表明此條件下加入胰島素的葡萄糖注射液不影響三七總皂苷的含量測(cè)定。

2．2 胰島素含量測(cè)定方法的建立[6－7]

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0．2 mol／L 硫酸鹽溶液（取無(wú)水硫酸鈉 28．4 g，加水溶解并加磷酸 2．7 mL，用乙醇胺調(diào)節(jié)pH 至 2．3，定容至 1 000 mL)－乙腈(74 ∶26)；流速：1．0 mL ／min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：317 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2．2．2 溶液制備

按照臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥，將注射用血栓通250 mg與10%葡萄糖注射液500 mL溶解后加入8 U胰島素，充分混合均勻，得供試品溶液。取胰島素對(duì)照品1．923mg，精密稱定，用0．01 mol／mL稀鹽酸配制成10 U／mL對(duì)照品貯備液。

2．2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取上述對(duì)照品貯備液0．05，0．10，0．30，0．50，1．00 mL 定容至 100 mL 容量瓶中，得質(zhì)量濃度為 0．005，0．01，0．03，0．05，0．10 U ／mL的胰島素溶液。取上述溶液各20 μL進(jìn)樣，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝6．192 3×103X－4．028 1，r＝0．999 9。結(jié)果表明，胰島素質(zhì)量濃度在0．005～0．100 U／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取線性關(guān)系項(xiàng)下配置的10 U／mL胰島素溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，按擬訂色譜條件分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0．87%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取線性關(guān)系項(xiàng)下配置的10 U／mL胰島素溶液，在放置 0，1，2，4，6，8 h 后分別進(jìn)樣，按擬訂色譜條件分析，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為1．04%(n＝6)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批胰島素對(duì)照品，按擬訂方法制備供試品溶液5份，分別精密吸取供試品溶液進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為1．25%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取線性關(guān)系項(xiàng)下配置的10 U／mL供試品溶液，分別加入8，10，12 U胰島素注射液，每組重復(fù)進(jìn)樣2次，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 胰島素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2．2．4 干擾試驗(yàn)

模擬臨床用藥，將注射用血栓通凍干粉250 mg溶于10%葡萄糖注射液500 mL中，并加入8 U胰島素，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）?？梢?jiàn)，此條件下注射用血栓通與葡萄糖注射液的配伍不會(huì)影響胰島素的含量測(cè)定。

2．3 配伍穩(wěn)定性試驗(yàn)

模擬臨床用藥方式，分別配置配伍液(A溶液、B溶液)，A溶液為注射用血栓通凍干粉250 mg溶于10%葡萄糖注射液500 mL中，B溶液為注射用血栓通凍干粉250 mg溶于10%葡萄糖注射液500 mL后加入8 U胰島素注射液，充分搖勻并置于室溫下，在 0，1，2，4，6，8，12 h時(shí)分別觀察及測(cè)定其外觀、pH、不溶性微粒、含量[8－9]。

圖1 高效液相色譜圖

外觀：將A溶液和B溶液分別加入干凈的10 mL具塞比色管中，在澄明度檢測(cè)儀下對(duì)其進(jìn)行澄明度、顏色的觀察，記錄 0，1，2，4，6，8，12 h 時(shí)瓶中藥液有無(wú)變化，是否存在白點(diǎn)、碎屑、不溶物等及顏色改變。結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，A溶液、B溶液外觀均澄清透明、無(wú)渾濁、沉淀產(chǎn)生，但在6 h后均有顏色變深的趨勢(shì)。

pH：將A溶液和B溶液在精密酸度計(jì)下測(cè)定0，2，4，6，8，12 h 時(shí)的 pH，結(jié)果見(jiàn)表 3。對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行 t檢驗(yàn)，無(wú)顯著性差異(P＞0．05)。表明注射用血栓通與胰島素在10%葡萄糖注射液中的配伍液12 h內(nèi)pH穩(wěn)定。

表3 配伍液在不同時(shí)間點(diǎn)pH和外觀變化

不溶性微粒：將A溶液、B溶液配伍液在澄明度檢測(cè)儀下按照2015年版《中國(guó)藥典(二部)》微粒檢測(cè)法中的光阻法檢查不同時(shí)間點(diǎn)的微粒數(shù)，記錄≥10 μm、≥25 μm的微粒數(shù)，同一樣品連續(xù)測(cè)定5組，取平均值[10－12]，結(jié)果見(jiàn)表4。藥典規(guī)定大于10 μm不溶性微粒數(shù)應(yīng)不大于25粒／mL，大于25μm的不溶性微粒數(shù)應(yīng)不大于3粒／mL。由表4可見(jiàn)，兩組配伍液微粒數(shù)在2 h內(nèi)變化不大；2～8 h配伍液微粒數(shù)有所上升，但均符合藥典規(guī)定；12 h測(cè)定的微粒數(shù)已超出藥典要求。

表4 配伍液不溶性微粒數(shù)試驗(yàn)結(jié)果（n＝5，粒／mL）

表5 配伍液中三七總皂苷和胰島素含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）

含量測(cè)定：取B溶液，在317 nm波長(zhǎng)下對(duì)三七總皂苷的含量進(jìn)行紫外分光光度檢測(cè)，記錄其吸光度值；再精密量取 10 μL，按 2．2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積和保留時(shí)間。以0 h時(shí)的含量為100．00%，分別測(cè)定配伍液中三七總皂苷和胰島素的含量變化情況，平行測(cè)定3次，詳見(jiàn)表5。結(jié)果表明，12 h內(nèi)配伍液中三七總皂苷和胰島素的含量略有下降，但變化很小，相對(duì)含量均大于98．25%。

3 討論

采用2015年版《中國(guó)藥典(二部)》中高效液相色譜法考察胰島素在配伍液中的變化，結(jié)果重復(fù)性好、靈敏度高，結(jié)果可靠。三七總皂苷的含量測(cè)定方法有重量法、比色法、高效液相色譜法。其中，重量法由于雜質(zhì)不易除凈，試驗(yàn)結(jié)果通常偏高；高效液相色譜法測(cè)定較復(fù)雜，需要對(duì)三七總皂苷中的每種成分分別進(jìn)行方法學(xué)考察。因此，本試驗(yàn)采用比色法對(duì)三七總皂苷進(jìn)行研究。

由本研究結(jié)果可知，在室溫下，注射用血栓通與胰島素在10%葡萄糖注射液中配伍，12 h內(nèi)無(wú)渾濁及沉淀產(chǎn)生，pH穩(wěn)定，無(wú)明顯變化；溶液外觀在6 h內(nèi)無(wú)變化，6 h后顏色均有變深趨勢(shì)；不溶性微粒2 h內(nèi)穩(wěn)定，2～8 h有所上升，但仍符合藥典要求，12 h后不溶性微粒超過(guò)藥典規(guī)定的數(shù)值；配伍液中的主要成分三七總皂苷及胰島素含量無(wú)明顯變化，且胰島素保留時(shí)間穩(wěn)定?？梢?jiàn)，注射用血栓通與胰島素在10%葡萄糖注射液中的配伍液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

中藥注射液成分復(fù)雜，其中的主要成分和未能除盡的雜質(zhì)成分與溶劑配伍后，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致溶液外觀顏色改變、微粒數(shù)增加[12－13]，因此配伍液應(yīng)在6 h內(nèi)使用，并建議使用精密輸液器或采用終端過(guò)濾裝置，減少微粒對(duì)人體造成的損害[14]。臨床使用中也盡量縮短放置時(shí)間，現(xiàn)配現(xiàn)用，以確保用藥的安全性。通過(guò)以上內(nèi)容的研究，并對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，可基本闡明注射用血栓通與胰島素在葡萄糖注射液中配伍后的穩(wěn)定性，為臨床合理應(yīng)用提供了理論參考。

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