晚期結(jié)直腸癌患者血漿cf DNA中 K－RAS突變及與西妥昔單抗耐藥的關(guān)系研究*

林 琳，龐雄昊，梁文麗，李美香

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518037)

晚期結(jié)直腸癌是種異質(zhì)性很大的疾病，腫瘤細(xì)胞遺傳的多樣性和腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)的易變性[1]為臨床診治帶來很多挑戰(zhàn)。臨床 K－RAS基因檢測的開展，為患者個體化治療邁出重要一步。多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，對于K－RAS野生型晚期結(jié)直腸癌患者，化學(xué)治療聯(lián)合西妥昔單抗治療有效率、無疾病進(jìn)展時間和總生存時間均得到明顯改善，但西妥昔單抗治療最終會出現(xiàn)進(jìn)展[2]。目前預(yù)測西妥昔單抗治療耐藥的指標(biāo)不多，Musella等[3]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目可以作為 RAS－BRAF野生型晚期結(jié)直腸癌的預(yù)后指標(biāo)，并可預(yù)測西妥昔單抗治療的失敗。cfDNA來源于腫瘤細(xì)胞的壞死或凋亡，半衰期數(shù)小時，能實(shí)時反映體內(nèi)腫瘤狀態(tài)，并攜帶腫瘤特異性基因改變，檢測手段相對成熟。Morgan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，相對于病理組織檢測 K－RAS突變，通過 PCR kit技術(shù)檢測晚期結(jié)直腸癌患者血漿中攜帶 K－RAS突變的cfDNA水平，發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性為31%和97%，可作為組織活檢的補(bǔ)充。Thierry等[5]通過定量PCR技術(shù)檢測晚期結(jié)直腸癌患者外周血中攜帶 K－RAS突變的cfDNA水平與組織學(xué)中 K－RAS突變情況，發(fā)現(xiàn)cfDNA的敏感性和特異性為92%和98%。因此，通過檢測晚期結(jié)直腸癌患者外周血血漿攜帶 K－RAS突變的cfDNA水平在臨床是可行的。為揭示檢測結(jié)直腸癌患者血漿cfDNA的 K－RAS突變情況和活組織檢測的差異，確定結(jié)直腸癌患者血漿cfDNA中的 K－RAS突變情況與西妥昔單抗治療效果的關(guān)系，解決臨床以影像學(xué)為主導(dǎo)的藥物治療療效和耐藥判定問題，本研究中探討了動態(tài)檢測患者外周血血漿中攜帶 K－RAS突變的cfDNA與患者預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1．1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)CT檢查證實(shí)可測量的病灶；經(jīng)病理組織學(xué)確診，組織病理學(xué)檢測結(jié)果為第Ⅳ期mCRC；氟尿嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康治療失敗；體能狀態(tài)評分（ECOG）為0～2分；各器官功能不存在明顯缺陷；本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),所有患者簽署知情同意書。

病例選擇：選擇醫(yī)院2015年6月至2017年6月收治的經(jīng)組織病理學(xué)確診的晚期結(jié)直腸癌患者100例，男67例，女 33例；年齡 62～78歲，平均（69．48±7．76）歲；結(jié)腸癌44例，直腸癌56例；肝臟轉(zhuǎn)移26例，肺轉(zhuǎn)移22例，盆腔轉(zhuǎn)移19例，縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，骨轉(zhuǎn)移15例。

1．2 方法

給藥方案：西妥昔單抗注射液（Merck KGaA，進(jìn)口藥品注冊證號 S20130004，規(guī)格每瓶為20 mL∶100 mg）靜脈滴注120 min，隨后每周250 mg／m2持續(xù)靜脈滴注60 min，2 個月后改為 500 mg／m2，每 2 周 1 次，與化學(xué)治療同時進(jìn)行。給藥前30 min常規(guī)給予組胺受體拮抗劑鹽酸異丙嗪注射液（廣東南國藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44022504，規(guī)格為每支 2 mL∶50 mg）25 mg 肌肉注射，地塞米松磷酸鈉注射液（國藥集團(tuán)容生制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字號 H41020036，規(guī)格為每支5 mg∶1 mL）5 mg靜脈注射，使用西妥昔單抗時行心電監(jiān)測。西妥昔單抗使用60 min后聯(lián)合細(xì)胞毒藥物。

FOLFIRI方案：鹽酸伊立替康注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20061276，規(guī)格為每支5 mL∶100 mg）180 mg／m2，靜脈滴注 30 ～90 min；亞葉酸鈣注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020177，規(guī)格為每支 5 mL ∶50 mg）200 mg／m2，靜脈滴注 2 h，第 1～2 天；5－氟尿嘧啶（5－FU，西南藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字 H50020128，規(guī)格為每支 10 mL ∶0．25 g）400 mg／m2，靜脈注射，第1天，聯(lián)合5－FU 2 400 mg／m2，持續(xù)靜脈泵入46 h，14 d為1個周期。所有患者使用化療方案＋表皮生長因子受體(EGFR)單抗治療。治療前后，檢測患者血液和穿刺組織中樣本的 K－RAS突變狀態(tài)，K－RAS突變型患者使用標(biāo)準(zhǔn)化方案，野生型患者使用西妥昔單抗首次 400 mg／m2持續(xù)。RECIST 版本 1．1和 NCI－CTCAE版本4．0用于檢查研究中的終點(diǎn)。

血液收集：通過外周血液抽吸,將7．5 mL全靜脈血收集在EDTA管（美國BD生物公司）中,保持于4℃冰箱直到分離，在收集后1 h內(nèi)進(jìn)行。將全血離心10 min（4℃，820 g），并將血漿級分轉(zhuǎn)移至2 mL冷試管（德國艾本得生物有限公司）中，再次離心 10 min（4 ℃，20 000 g），并在新鮮的2 mL管中回收純血漿，于－80℃下立即儲存，直到cfDNA提取。

DNA提?。焊鶕?jù)說明書，使用 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德國凱杰生物有限公司）從血漿中提取循環(huán)的無細(xì)胞DNA。取2 mL血漿進(jìn)行cfDNA提取，并在50 μL洗脫緩沖液中回收cfDNA，4℃保存。

cfDNA定量：通過使用Qubit 2．0熒光計(jì)（美國賽默飛世爾有限公司）的熒光測量法確定cfDNA的總量。通過QIAamp循環(huán)核酸試劑盒獲得的2 μL DNA洗脫液，并根據(jù)說明書使用Qubit dsDNA HS測定試劑盒（美國賽默飛世爾有限公司）測定濃度。

K－RAS突變檢測和定量:為了鑒定 K－RAS突變，回顧了FFPE腫瘤樣品的HE染色載玻片，選擇腫瘤組織進(jìn)行分析。通過微觀解剖去除來自2個未染色、5 μm厚組織切片的相應(yīng)組織，并通過在TEN緩沖液（1 mmoL EDTA，10 mmoL TRIS － HCl，0．1 moL NaCl，pH 8．0）中孵育將組織裂解，包括蛋白酶K（20 g／L）過夜，62℃。將所得裂解物用于PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增編碼 K－RAS外顯子 2(密碼子 12／13)，外顯子 3(密碼子 59和 61)，以及 K－RAS的外顯子4（密碼子117和146）的區(qū)域基因。將 3 μL 裂解液加入 47 μL PCR 反應(yīng)中，包括 25 μL PCR Master Mix S（美國賽默飛世爾有限公司），0．5 μL特異性 PCR引物混合物（每個引物25 pmol）和21．5 μL Millipore H2O。循環(huán)條件為，95℃ 5 min；2× [95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s]；2× [95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s]；2× [95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s]；35× [95℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s]；72 ℃ 10 min。在 1% 瓊脂糖凝膠上分離PCR反應(yīng)的一部分，以確保 K－RAS區(qū)域的成功擴(kuò)增。不同 K－RAS的突變狀態(tài)通過使用PyroMark Q24型測序儀（德國凱杰生物有限公司）的熱測序確定密碼子。根據(jù)QIAGEN的pyro－sequencing試劑的使用說明進(jìn)行熱解測序。所有引物的序列可根據(jù)要求提供。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 7版本分析。除非另有說明，連續(xù)變量的結(jié)果以平均值±中值絕對偏差或平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，行Student′s t檢驗(yàn)或 Mann－Whitney U檢驗(yàn)；分類變量的比較行Fisher精確檢驗(yàn)生存曲線行Mantel－Cox對數(shù)秩檢驗(yàn)；相關(guān)分析由Pearson或Spearman相關(guān)分析進(jìn)行。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 治療前后 K－RAS突變豐度對比

首先，在轉(zhuǎn)移性CRC的初步診斷中，應(yīng)用了 K－RAS基因熱點(diǎn)區(qū)域的ARMS－PCR檢測cfDNA和腫瘤組織中 K－RAS突變情況。評估了外顯子2（密碼子12／13）、外顯子3（密碼子 59和61）和外顯子 4（密碼子 117和146）的 K－ RAS狀態(tài)，并鑒定了 82．50%（33／40），其中cfDNA和組織中均檢測出的 K－RAS突變的一致性為62．50%。使用來自相應(yīng)患者的 cfDNA的 ARMS－PCR技術(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充，結(jié)果見表1。可見，cfDNA可作為無法取到組織樣本時的一種可行的檢測方法。

表1 治療前后cfDNA的突變豐度比較(，%)

表1 治療前后cfDNA的突變豐度比較(，%)

時間治療前治療后t值P cfDNA 17．00 ± 12．05 8．10 ± 7．98 9．287＜ 0．000 1腫瘤組織26．40 ± 9．80 12．60 ± 2．55 11．486＜ 0．000 1

2．2 K－RAS狀態(tài)與西妥昔單抗耐藥間的關(guān)系分析

1例患者中，原發(fā)腫瘤組織是 K－RAS外顯子2－4的野生型，同時cfDNA分析也證實(shí)了 K－RAS表達(dá)為野生型，給予患者FOLFIRI＋西妥昔單抗進(jìn)行治療，見圖1 A。在疾病進(jìn)展后，檢測到 K－RAS呈現(xiàn)突變狀態(tài)，且相較于傳統(tǒng)的血清學(xué)和影像學(xué)檢測，cfDNA的檢測更方便、準(zhǔn)確，可實(shí)時動態(tài)監(jiān)控患者的疾病狀態(tài)。另1例患者，腫瘤組織也被確定為 K－RAS外顯子2－4的野生型，但cfDNA檢測到的 K－RAS 3號外顯子突變，即是Q61H，由于組織分析是當(dāng)時 K－RAS評估的標(biāo)準(zhǔn)，患者接受了FOLFIRI＋帕尼單抗（患者自行購買）治療。結(jié)果顯示，K－RAS突變在治療開始后1個月，cfDNA中并沒有 K－RAS突變，可能是由于采用細(xì)胞毒劑（伊立替康）治療。約5個月后（即放射學(xué)確認(rèn)的疾病進(jìn)展前超過2個月），cfDNA中再次檢測到相同的突變，詳見圖1 B。結(jié)果表明，與單次cfDNA定量相比，基于cfDNA的 K－RAS篩查在治療期間早期檢測疾病進(jìn)展有潛在價值，EGFR單抗治療中 K－RAS的突變狀態(tài)是導(dǎo)致耐藥的重要因素。

2．3 K－RAS狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)cfDNA中基因表達(dá)水平進(jìn)行患者的生存分析已被用于多類型的癌癥，匯總分析證實(shí)，cfDNA中 K－RAS水平升高的總生存期(OS)縮短。在腫瘤中腫瘤體積和腫瘤中cfDNA的含量存在正相關(guān)關(guān)系。詳見圖2A。K－RAS的突變豐度在無疾病生存期（PFS）中有著顯著差異（P＝0．047），見圖2B。K－RAS野生型患者和 K－RAS突變型患者OS也存在顯著差異，野生型患者中位OS為10．2個月（8．3～11．7）個月，突變型患者的中位 OS 為 5．2 個月（4．6 ～5．9）個月（HR＝1．78，P ＝0．000 6），詳見圖 2 C。故cfDNA中 K－RAS的狀態(tài)和患者預(yù)后存在明顯的相關(guān)性。

3 討論

圖1 K－RAS狀態(tài)與西妥昔單抗耐藥的關(guān)系

圖2 K－RAS狀態(tài)與預(yù)后的關(guān)系

隨著手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療等綜合治療手段的進(jìn)步，早期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后得到明顯改善，但仍有50%～60%的結(jié)直腸癌患者確診時已伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；熕幬锛吧锇邢蛩幬锏呐R床應(yīng)用，晚期結(jié)直腸癌患者OS延長至30多個月以上，且提高了生活質(zhì)量[6]。

研究表明，患者待檢測樣品中可分離并分析特定的基因和腫瘤的關(guān)系[7]。cfDNA于1948年首次被描述，已作為潛在的癌癥患者體征的說明[8－10]。對于動態(tài)cfDNA分析，集中在臨床相關(guān)的2個時間點(diǎn)，即治療前和治療后，可通過成像確定。本研究中，治療前cfDNA中 K－RAS的突變豐度呈明顯變化，治療前后組織中 K－RAS突變豐度明顯高于cfDNA中 K－RAS，組織中腫瘤細(xì)胞的含量更高，外周血中腫瘤細(xì)胞的含量相對低于腫瘤組織，故檢測結(jié)果中存在細(xì)微差異。一致性方面，cfDNA和腫瘤組織中同時檢測的 K－RAS突變比例達(dá)62．50%，這與以往研究數(shù)據(jù)[11－12]一致。因此，結(jié)直腸癌患者治療過程中行K－RAS定量對腫瘤采取無創(chuàng)治療方法具有指導(dǎo)意義。

K－RAS基因的突變對于結(jié)直腸癌患者后續(xù)治療方案的選擇有重要意義。有研究顯示，K－RAS位于EGFR基因下游，對于 K－RAS基因突變的患者，EGFR單抗類藥物獲益程度不大[13]。本研究中，在EGFR野生型患者，K－RAS治療前突變?yōu)?，但隨著治療的深入，K－RAS基因的突變豐度增加，特別是在再次發(fā)生疾病進(jìn)展時突變豐度明顯升高；同時，cfDNA的檢測方法相較于傳統(tǒng)的影像學(xué)和血清學(xué)的檢測更方便，且可檢出突變的時間略微提前。目前，許多研究集中在 K－RAS的發(fā)生和突變的復(fù)發(fā) K－RAS抗下等位基因EGFR治療[14－16]。但目前臨床仍不清楚該如何處理這些結(jié)果。關(guān)于組織cfDNA之間發(fā)生 K－RAS突變時如何選擇，本研究結(jié)果顯示，K－RAS突變確實(shí)可在化療加抗EGFR抗體的組合下消失，且在疾病進(jìn)展時被再次檢測出。因此，在某些情況下，明顯的聯(lián)合化療也能抑制結(jié)直腸癌中的 K－RAS突變。

基因突變與患者的無疾病生存率及總生存率存在一定的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，K－RAS突變的患者總生存率明顯低于 K－RAS野生型患者，且無疾病生存率也展現(xiàn)出類似結(jié)果，故對于腫瘤患者熱點(diǎn)基因的檢測就顯得至關(guān)重要。晚期結(jié)直腸癌患者 K－RAS的狀態(tài)和臨床用藥及預(yù)后存在明顯的相關(guān)性。

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