促紅細胞生成素經(jīng)超聲微泡介導治療大鼠損傷面神經(jīng)的研究*

蘇俊波，駱文龍，郝亞寧，王德平，劉 進

（重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶 400010）

面神經(jīng)是支配面部表情肌的混合神經(jīng)，若受損易致面癱，損傷后的修復是多學科合作的重要研究領域。近年來，學者們逐漸認識到神經(jīng)生長微環(huán)境的重要性，并發(fā)現(xiàn)了多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，其中促紅細胞生成素(EPO)主要由腎臟合成，有促進紅細胞生成作用[1]。EPO及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布，具有抗凋亡、抗炎、促進神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放和神經(jīng)再生等作用[2]。但EPO在人體內(nèi)降解較快，全身給藥神經(jīng)營養(yǎng)效果不佳。微泡造影劑利用超聲波與微泡造影劑相互作用所產(chǎn)生的生物學效應，可實現(xiàn)靶向治療。本研究中運用超聲靶向微泡(UTMD)介導EPO基因治療大鼠面神經(jīng)損傷，觀察治療后EPO基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及治療效果，為研究和評價超聲靶向微泡介導的面神經(jīng)基因轉(zhuǎn)染提供可靠依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1．1 儀器、試藥與動物

儀器：超聲轉(zhuǎn)染儀，BL－6420C型生物信號采集與處理系統(tǒng)及脂質(zhì)微泡（白色凍干粉末狀）由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院超聲影像學研究所提供。

試藥：EPO液由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝病研究治療中心提供，PT－PCR引物，Trizol試劑由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

實驗動物：清潔級成年健康SD大鼠（雌雄不限），40只，體質(zhì)量 220～230 g，許可證號為 SCXK（渝）2012－0001，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，遵循實驗動物倫理學原則進行處置。

1．2 方法

1．2．1 質(zhì)粒提取

EPO液經(jīng)大腸桿菌擴增16 h后，提取純化，經(jīng)酶切電泳鑒定，紫外分光光度計測定質(zhì)量濃度為1 g／L。

1．2．2 脂質(zhì)微泡與EPO基因的結合

脂質(zhì)微泡中加入2 mL生理鹽水混合搖勻，微泡直徑 3～5 μm，濃度 0．5×108～1．0×108／mL。加入含 EPO基因溶液（質(zhì)粒質(zhì)量濃度為 1 g ／L）0．5 mL，混勻，室溫下靜置30 min，使基因充分黏附，檢測混合液中質(zhì)粒量濃度為 0．2 g ／L。

1．2．3 動物模型制作

采用5%戊巴比妥30 mg／kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，局部注射5%利多卡因追加麻醉；在手術顯微鏡下切開大鼠右側(cè)顳骨骨泡，用磨磚磨去面神經(jīng)鐙骨肌支骨管約3 mm，蚊式鉗鉗夾面神經(jīng)干長約2 mm，力量為三扣，持續(xù)60 s，松開30 s，再鉗夾60 s，手術顯微鏡觀察，面神經(jīng)損傷程度為束膜性神經(jīng)中斷，符合Sunderland損傷Ⅳ度[3]，縫合皮膚。各大鼠術后混合飼養(yǎng)。

1．2．4 動物分組及給藥

應用隨機數(shù)字表法將面神經(jīng)損傷大鼠分為4組，每組10只。A組：EPO＋超聲組，經(jīng)股靜脈插管注入含EPO 0．2 mg基因溶液1 mL，并使用超聲轉(zhuǎn)染儀緊貼大鼠面神經(jīng)受損部位體外照射，功率0．75 W／cm2，頻率1 MHz，照射 10 s，間隔 10 s，共 2 min； B 組：EPO ＋ 微泡組，經(jīng)股靜脈注入載基因微泡溶液1 mL；C組：EPO＋超聲＋微泡組，注入載基因微泡溶液1 mL，再用超聲觸發(fā)，參數(shù)同A組；D組：單純手術組，輸入1 mL PBS作為對照。

1．2．5 一般狀況觀察

于面神經(jīng)損傷后第1，7，14，28天觀察每組大鼠進食、活動、眼部閉合、鼻尖偏向、胡須擺動、局部皮膚肌肉情況。

1．2．6 神經(jīng)電生理檢測

面神經(jīng)損傷后第28天，以10%水合氯醛麻醉大鼠并固定，將記錄電極插入面神經(jīng)支配的面頰肌，電極間距約為4～6 mm，深度為（4±1）mm。針灸針刺激電極分插至神經(jīng)損傷處近中樞段和外周端肌肉，采用BL－6420C型生物信號采集與處理系統(tǒng)，以波寬1 ms的正方波刺激，頻率60 Hz，電流從0 mA開始，至出現(xiàn)動作電位。測定面神經(jīng)動作電位波幅、潛伏期及傳導速度。

1．2．7 標本采集

面神經(jīng)損傷大鼠模型經(jīng)基因轉(zhuǎn)染28 d后，以10%水合氯醛 3．5 mL／kg腹腔注射麻醉大鼠；采用升主動脈插管，剪開右心耳；快速灌注生理鹽水300 mL，至右心耳流出血液完全變清；立即用4%多聚甲醛PBS液，先快后慢灌注約250 mL，直至大鼠四肢僵硬。切取損傷處神經(jīng)組織約1 mm。

1．2．8 損傷面神經(jīng)組織中EPO基因mRNA轉(zhuǎn)錄的檢測

采用PT－PCR法，引物由武漢谷歌生物科技有限公司提供，根據(jù)GenBank中登錄的EPO基因合成。提取損傷處面神經(jīng)組織RNA（Trizol試劑），以合成的cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增（反應條件:94℃、30 s，54 ℃ 、30 s，72 ℃ 、40 s，共 35 個循環(huán)）。mRNA 水平用β－actin作為內(nèi)標，以擴增倍數(shù)＝2－△△CT表示基因相對表達量。

1．3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多個樣本均數(shù)間兩兩比較行 q檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 大鼠一般狀況

各組大鼠術后無死亡，切口無感染。面神經(jīng)損傷后第1天，每組大鼠均出現(xiàn)飲食降低，活動范圍縮小。損傷側(cè)胡須倒伏、無擺動，鼻尖左偏，無閉眼；轉(zhuǎn)染后第7天，各組大鼠胡須擺動情況較第1天無好轉(zhuǎn)，組間無顯著差別；損傷后第14天，A組、B組、D組大鼠仍無明顯變化，C組大鼠術側(cè)有少量胡須可觀察到細微擺動，鼻尖仍向左偏，有上瞼細微運動；術后第28天，A組、B組、D組大鼠術側(cè)胡須較前有明顯恢復，A組大鼠胡須部分向前豎起，但擺動無力，鼻尖稍偏左，右眼閉合不完全，C組大鼠術側(cè)胡須可見有力的節(jié)律性擺動，鼻尖基本居中，右眼可閉合，肌肉萎縮較其余組大鼠程度輕。

2．2 神經(jīng)電生理檢測指標

C組大鼠面神經(jīng)動作電位波幅和面神經(jīng)傳導速度高于A組、B組、D組，潛伏期低于其余3組(P＜0．05)。詳見表1。

表1 各組大鼠轉(zhuǎn)染后第28天損傷面神經(jīng)電生理檢測指標比較(±s，n＝10)

表1 各組大鼠轉(zhuǎn)染后第28天損傷面神經(jīng)電生理檢測指標比較(±s，n＝10)

組別A組B組C組D組面神經(jīng)傳導速度（m ／s)14．8 ± 0．3 14．0 ± 0．2 17．8 ± 0．3 13．9 ± 0．4潛伏期（ms)8．8 ± 0．2 9．7 ± 0．3 7．9 ± 0．5 10．6 ± 0．3面神經(jīng)動作電位波幅(μV)7．6 ± 0．4 5．6 ± 0．5 11．0 ± 0．8 5．4 ± 0．6

2．3 大鼠損傷處神經(jīng)組織中EPO mRNA轉(zhuǎn)錄水平

C組大鼠面神經(jīng)損傷處EPO mRNA表達量明顯高于 A 組、B 組、D 組（P ＜0．05）。詳見圖 1。

3 討論

圖1 大鼠損傷處神經(jīng)組織中EPO基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平

面神經(jīng)從橋腦發(fā)出，經(jīng)過內(nèi)聽道及巖骨中狹長的骨性管道－面神經(jīng)管，通過莖乳孔出顱腔，在這之間的任何部位受到損傷，皆可導致部分性或完全性面癱。目前，面神經(jīng)損傷的治療多強調(diào)手術修復，但手術治療存在風險，手術的適應證及獲益仍不明確。研究發(fā)現(xiàn)，面神經(jīng)損傷后的功能修復需要神經(jīng)元胞體的存活和軸突的延伸。遠端面肌來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子向神經(jīng)元胞體逆行性運輸發(fā)生障礙，使損傷局部神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏，導致軸突再生的微環(huán)境遭到破壞[4]。此外，損傷細胞凋亡機制參與了面神經(jīng)元的變性和死亡[5]。

EPO已被證實是一種新型的神經(jīng)保護因子[6]，其與EPO受體結合后，使JAK2發(fā)生自體磷酸化，通過激活磷脂酰肌醇3，進一步激活 STAT－5?；罨?JAK2激活Bcl－2相關的細胞死亡促進蛋白等底物，發(fā)揮抑制凋亡作用；同時，活化的STAT－5移至細胞核，刺激線粒體內(nèi)抗凋亡蛋白的釋放，并通過抑制與細胞色素C釋放有關的基因活性，減少凋亡發(fā)生[7]。

Viviani等[8]發(fā)現(xiàn)，EPO能誘導腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，而BDNF在神經(jīng)保護作用中也具有重要地位。另外，EPO能增加星型膠質(zhì)細胞釋放β－神經(jīng)生長因子（β－NGF）促進神經(jīng)元生長。在坐骨神經(jīng)損傷的動物試驗中發(fā)現(xiàn)，EPO組損傷處雪旺氏細胞數(shù)量較對照組明顯增加，體外試驗則發(fā)現(xiàn)，EPO通過激活JAK2機制，刺激雪旺細胞增殖[9]。在自身免疫性腦脊髓炎動物模型中，EPO可增強少突膠質(zhì)細胞的增殖和促進髓鞘的再生。本研究中，C組大鼠的面神經(jīng)功能恢復較A組、B組、D組好，術側(cè)胡須擺動、右眼閉合情況及鼻尖位置及均優(yōu)于A組、B組、D組；神經(jīng)電生理方面，C組大鼠的面神經(jīng)動作電位波幅、面神經(jīng)傳導速度及潛伏期也明顯優(yōu)于A組、B組、D組，進一步證實了EPO的神經(jīng)營養(yǎng)作用。

EPO有促進紅細胞生成的作用，全身用藥將會引起血液黏稠、血栓形成，甚至產(chǎn)生抗EPO抗體，出現(xiàn)純紅細胞再生障礙性貧血。超聲微泡作為載體不但可在體循環(huán)中減少藥品不良反應，提高病變區(qū)域的藥物濃度，還可保護基因片段不被清除和降解[10]。同時，超聲微泡作為一種非病毒載體，具有轉(zhuǎn)染效率高、制備簡易、無免疫原性等優(yōu)勢[11]。本研究中C組大鼠面神經(jīng)損傷處EPO基因mRNA的表達量也顯著高于A組、B組、D組。說明超聲微泡造影劑能與目的基因有效結合，將目的基因轉(zhuǎn)染靶組織，為修復受損面神經(jīng)提供了安全、高效的途徑。

綜上所述，超聲微泡介導EPO對受損面神經(jīng)具有修復作用，為面神經(jīng)的生物學治療提供了新方法。

[1]Recny MA，Scoble HA，Kim Y．Structural characterization of natural human urinary and recombinant DNA －derived erythropoietin．Identification of des－ arginine 166 erythropoietin[J]．The Journal of Hiological Chemistry，1987，262(35)：17156 － 17163．

[2]代喻兵，駱文龍，陳紅江，等．面神經(jīng)損傷后rhEPO對面神經(jīng)運動神經(jīng)元的保護作用[J]．中國康復醫(yī)學雜志，2008，23（6）：491－494．

[3]任國山，趙長義，張喜平，等．面神經(jīng)在不同功能狀態(tài)下所需神經(jīng)元的定量分析[J]．中國臨床康復，2005，9(25)：40 － 41．

[4]劉 陽，蘇俊波，駱文龍．肝細胞生長因子對面神經(jīng)損傷后運動終板及肌纖維修復作用的研究[J]．重慶醫(yī)學，2004，33(8):1231－1233．

[5]Butler DP，Grobbelaar AO．Facial palsy:what can the multidisciplinary team do？[J]．Journal of multidisciplinary healthcare，2017，10：377 － 381．

[6]Campana WM，Myers RR．Erythropoietin and erythropoietin receptors in the peripheral nervous system:changes after nerve injury[J]．FASEB Journal:Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2001，15(10):1804 － 1806．

[7]Egrie JC，Dwyer E，Browne JK，et al．Darbepoetin alfa has a longer circulating half－life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin[J]．Experimental hematology，2003，31(4):290－299．

[8]Viviani B，Bartesaghi S，Corsini E，et al．Erythropoietin protects primary hippocampal neurons increasing the expression of brainderived neurotrophic factor[J]．Journal of Neurochemistry，2005，93(2):412－421．

[9]Kang SY，Kang JH，Choi JC，et al．Expression of erythropoietin in the spinal cord of lewis rats with experimental autoimmune encephalomyelitis[J]．Journal of Clinical Neurology，2009，5(1):39－45．

[10]Ho YJ，Chang YC，Yeh CK．Improving Nanoparticle Penetration in Tumors by Vascular Disruption with Acoustic Droplet Vaporization[J]．Theranostics，2016，6(3):392 － 403．

[11]Sato M，Motoyoshi M，Shinoda M，et al．Noriyoshi Shimizu．Low －intensity pulsed ultrasound accelerates nerve regeneration following inferior alveolar nerve transection in rats[J]．Eur J Oral Sci，2016，124(3):246 － 250．