基于I TS2條形碼的貫葉金絲桃及其混偽品鑒別研究*

楊宋琪，唐小龍，陳海燕，柯 瀟

（四川濟(jì)生堂藥業(yè)有限公司，四川 成都 610041）

貫葉金絲桃 Hypericum perforatum L．，別名貫葉連翹、千層樓、圣約翰草等，為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲和亞洲，在我國(guó)陜西、甘肅、山東、新疆、四川、貴州等地均有分布[1－3]?，F(xiàn)代研究表明，其成分金絲桃素、偽金絲桃素在抗抑郁、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒等方面具有較高的開(kāi)發(fā)價(jià)值，是鎮(zhèn)定劑、抗炎藥、抗抑郁藥、抗腫瘤及艾滋病等病毒疾病治療藥物，特別是抗抑郁制劑的重要原料[4－6]。貫葉金絲桃的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致其資源供不應(yīng)求，民間常用其他類(lèi)似品種代替，使其藥材品種質(zhì)量混亂加劇。傳統(tǒng)的性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定在中藥材的物種鑒定上有一定局限性[7]，為了保證中藥材臨床應(yīng)用準(zhǔn)確、安全、有效，對(duì)其準(zhǔn)確鑒定很有必要。DNA條形碼技術(shù)最先由加拿大動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert提出，通過(guò)測(cè)定植物DNA序列進(jìn)行比較，反映其遺傳差異，以進(jìn)行物種分類(lèi)和鑒定[8－10]。ITS2序列是目前首推的作為植物鑒別的DNA條形碼之一，包含豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，對(duì)植物有較高的鑒別能力[11－12]。有研究表明，核ITS2序列的鑒定能力優(yōu)于國(guó)際條形碼協(xié)會(huì)植物工作組提出的matK和rbcL組合，首次提出將ITS2作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列[13]。本研究中應(yīng)用ITS2條形碼序列鑒別貫葉金絲桃及其混偽品，以期為貫葉金絲桃中藥材準(zhǔn)確鑒定提供新方法。

1 材料與方法

1．1 材料

收集來(lái)自于甘肅地區(qū)的貫葉金絲桃及其混偽品90份，另從GenBank中下載3條貫葉金絲桃ITS2條形碼序列，基因登錄號(hào)為GQ434761，GU596502和EU796888。樣本信息見(jiàn)表1。

表1 貫葉金絲桃及其混偽品的樣本信息

1．2 方法

1．2．1 DNA 提取和 PCR 擴(kuò)增

采用北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司植物基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào) TSP101）提取貫葉金絲桃及其混偽品的總 DNA。使用植物 ITS2區(qū)通用引物(ITS2F： 5′－ATGCGATACTTGGTGTGAAT－3′；ITS2R：5′－GACGCTTCTCCAGACTACAAT －3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系在200 μL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)體系包括：購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司的高保真 PCR反應(yīng)預(yù)混液 I－5TM2×High － Fidelity Master Mix 12．5 μL，ITS2F 1 μL，ITS2R 1 μL，DNA 0．5 μL，ddH2O 10 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性 2 min，循環(huán)反應(yīng) 35次（98℃ 10 s，56℃ 10 s，72℃ 30 s），72 ℃ 延伸 3 min，8℃ 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1．2．2 數(shù)據(jù)處理

采用CodonCode Aligner對(duì)所得序列峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列，由基于隱馬爾可夫模型(Hmmer)的注釋方法切除ITS2兩端的5．8S和28S區(qū)域，獲得標(biāo)準(zhǔn)的ITS2間隔區(qū)序列[14]，將獲得的ITS2序列提交到中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http:／／www．tcmbarcode．cn)或 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)用 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行序列比對(duì)。同時(shí)將所得ITS2序列利用MEGA 6．0進(jìn)行多重比對(duì)，基于Kimura－2－parameter(K2P)模型計(jì)算遺傳距離，并采用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(NJ樹(shù))，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，獲得二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 DNA提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

本研究中提取樣本的基因組DNA，條帶清晰，無(wú)明顯降解，無(wú)蛋白和多酚多糖污染，滿(mǎn)足后續(xù)擴(kuò)增試驗(yàn)要求。貫葉金絲桃及混偽品經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)均得到約為700 bp大小的片段。PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序均獲得成功，經(jīng)拼接后獲得高質(zhì)量的序列。

2．3 種內(nèi)種間變異

貫葉金絲桃種內(nèi)序列共87條，ITS2序列長(zhǎng)度為236 bp，變異位點(diǎn)為3個(gè)。種內(nèi)最大K2P距離為0．004。貫葉金絲桃混偽品共3條序列，分別為36號(hào)樣本一年蓬 Erigeron annuu，78號(hào)樣本蓍Achillea和90號(hào)樣本長(zhǎng)柱金絲桃 Hypericum ascyron，ITS2序列長(zhǎng)度分別為212，206，230 bp。36號(hào)樣本一年蓬 Erigeron annuu與貫葉金絲桃種間最小K2P遺傳距離分布為0．490；78號(hào)樣本蓍 Achillea與貫葉金絲桃種間最小K2P遺傳距離分布為0．320；90號(hào)樣本長(zhǎng)柱金絲桃 Hypericum ascyron與貫葉金絲桃種間最小K2P遺傳距離分布為0．107。

2．4 NJ樹(shù)分析

利用MEGA6．0，采用鄰接法，基于本研究中獲得的所有ITS2單倍型序列和GenBank中下載的3條貫葉金絲桃 ITS2條形碼序列，基因登錄號(hào) GQ434761，GU596502和EU796888構(gòu)建聚類(lèi)NJ樹(shù)(圖 1)。由構(gòu)建的NJ樹(shù)可見(jiàn)，與和GenBank中下載的3條貫葉金絲桃ITS2條形碼序列聚在一大支上的均為真的貫葉金絲桃，而36，78，90這3個(gè)樣本的ITS2條形碼序列單獨(dú)聚為一支，為貫葉金絲桃偽混品。

2．5 貫葉金絲桃及其混偽品ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù) http: ／／its2．bioapps．biozentrum．uniwuerzburg．de／所預(yù)測(cè)的供試樣本的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果可見(jiàn)，所有物種的二級(jí)結(jié)構(gòu)均為一個(gè)中心環(huán)及4個(gè)螺旋區(qū)構(gòu)成，每個(gè)螺旋上又有或多或少的大小不一的莖、環(huán)結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)GenBank中下載的3條貫葉金絲桃ITS2條形碼序列，以及和這3條序列聚類(lèi)最近的16，29，81樣本，還有36，78，90這 3個(gè)混偽品的 ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。貫葉金絲桃的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)為一個(gè)中心環(huán)（主環(huán)），在螺旋Ⅰ區(qū)上有4個(gè)莖環(huán)，在螺旋Ⅱ區(qū)有3個(gè)莖環(huán)，在螺旋Ⅲ區(qū)有6個(gè)莖環(huán)，在螺旋Ⅳ區(qū)有2個(gè)莖環(huán)。而36號(hào)樣本一年蓬 Erigeron annuus和78號(hào)樣本蓍 Achillea millefolium與貫葉金絲桃ITS2條形碼序列二級(jí)結(jié)構(gòu)均有差異。90號(hào)樣本長(zhǎng)柱金絲桃 Hypericum ascyron與貫葉金絲桃ITS2條形碼序列二級(jí)結(jié)構(gòu)的中心主環(huán)和Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ個(gè)螺旋區(qū)有差異。

3 討論

貫葉金絲桃應(yīng)用廣泛，市場(chǎng)上充斥著各種混偽品，傳統(tǒng)的鑒定方法有其局限性。利用DNA條形碼技術(shù)，從分子水平上對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定很有必要。

理想的DNA條形碼通常需要滿(mǎn)足以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：物種水平具有顯著的遺傳變異和分化，能鑒別不同物種；合適的長(zhǎng)度，便于DNA擴(kuò)增、測(cè)序、拼接及排序時(shí)不需要手動(dòng)調(diào)整；目的片段兩端具有保守位點(diǎn)，可用于通用引物設(shè)計(jì)。ITS2正是具有以上優(yōu)點(diǎn)被提出作為藥用植物鑒定的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列。同時(shí)，作為分子系統(tǒng)進(jìn)化研究中最重要的標(biāo)記之一，ITS2序列在物種水平或種下水平具有明顯的序列變異性，其二級(jí)結(jié)構(gòu)可提高系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重建的準(zhǔn)確性[13－14]。本研究中針對(duì)貫葉金絲桃及混偽品運(yùn)用ITS2擴(kuò)增測(cè)序均能很好地完成；同時(shí)，貫葉金絲桃種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0．004，與其混偽品種間 K2P遺傳距離分布為 0．107～0．490，可見(jiàn) ITS2條形碼序列在貫葉金絲桃種間變異和分化顯著，能將不同種區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖1 基于ITS2條形碼構(gòu)建的貫葉金絲桃及其混偽品的NJ樹(shù)

由NJ樹(shù)可知，所有貫葉金絲桃均聚在一大枝上，可將其余混偽品區(qū)分。同時(shí)，預(yù)測(cè)貫葉金絲桃及其混偽品ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)貫葉金絲桃種類(lèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)保守，與其偽混品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，在螺旋Ⅱ區(qū)均相對(duì)保守，在Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ螺旋區(qū)有差異，進(jìn)一步提高了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重建的準(zhǔn)確性。由本研究結(jié)果可見(jiàn)，基于ITS2條形碼技術(shù)可對(duì)貫葉金絲桃原植物及其藥材與混偽品進(jìn)行準(zhǔn)確、快速地鑒定，可作為傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充，為市場(chǎng)上貫葉金絲桃藥用植物的鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

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