云南昆明煙草主產(chǎn)區(qū)根結線蟲種類及分布研究*

徐興陽,彭昌田,顧進坤,李鳳麗,李浩昊,李 順,胡先奇

(1.云南省煙草公司 昆明市公司,云南 昆明 650051;2.紅河佳裕農(nóng)業(yè)科技有限公司,云南 紅河 654300; 3.云南省煙草公司 文山州公司,云南 文山 663000;4.云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院,云南 昆明 650201)

煙草具有重要經(jīng)濟價值,其產(chǎn)業(yè)在我國具有重要地位.煙葉生產(chǎn)可以幫助煙農(nóng)增收,鞏固全面脫貧實現(xiàn)全面小康,助力鄉(xiāng)村振興.在煙葉生產(chǎn)中,煙草病蟲害可直接影響煙葉的品質與產(chǎn)量,成為煙葉生產(chǎn)的重要制約因素.當前,我國較為流行的煙草病害主要包括煙草黑脛病、煙草花葉病、番茄斑萎病毒病、煙草根結線蟲病和赤星病等,其中煙草根結線蟲病備受關注.

煙草根結線蟲病屬于世界性病害,在我國各大煙區(qū)呈逐漸加重趨勢,造成重大經(jīng)濟損失,已成為煙草生產(chǎn)的重要限制因子.朱斌等[1]研究表明陜南煙區(qū)煙草根結線蟲病發(fā)病率最高可達100%.云南煙草根結線蟲病年發(fā)病面積超過3.3×104hm2,損失煙葉比例范圍在20.0%～30.0%,嚴重達50.0%以上[2],其中昆明煙草受根結線蟲危害最嚴重的一次其局部連片受災面積達到 400 hm2[3].

根結線蟲(Meloidogynespp.)屬于墊刃目(Tylenchida),異皮科(Heteroderidae),根結線蟲屬(Meloidogyne),其適應能力、繁殖能力強,寄主植物超過3 000種[4].根結線蟲幼蟲有4個齡期,從卵中孵化出的2齡幼蟲具有侵染能力,2齡幼蟲主要從根冠伸長區(qū)侵入寄主,通過口針的穿刺作用使食道腺分泌的酶入侵根部組織,導致根結的形成[5].

我國煙草根結線蟲病主要有南方根結線蟲(M.incongnita)、爪哇根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)和北方根結線蟲(M.hapla)[6],根據(jù)已有的調查結果,在我國大部分地區(qū),南方根結線蟲是主要的優(yōu)勢種.對煙草根結線蟲的鑒定主要采用形態(tài)特征和分子生物學特征分析.形態(tài)特征主要包括:雌成蟲會陰花紋、雌成蟲和2齡幼蟲形態(tài)特征.分子生物學鑒定常用方法主要有聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)、序列特異性擴增區(qū)(Sequence Characterized Amplified Region,SCAR)等.Carolien等[7]基于SCAR-PCR技術,設計了3對特異性引物,準確鑒定出南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲.杜惠等[8]利用 rDNA-ITS-PCR 技術通過11個根結線蟲種群進行分析,確定甘肅當?shù)厥卟烁Y線蟲種類為南方根結線蟲.

云南省是全國最主要的煙葉產(chǎn)區(qū),昆明市作為云南煙葉產(chǎn)區(qū)的重要組成部分,其煙葉品質與產(chǎn)量一直深受行業(yè)高度關注.然而,當前昆明煙草根結線蟲病已成為煙草種植過程中的主要病害,局部區(qū)域已經(jīng)成為決定性制約因子.本文擬通過對昆明全市煙草主要種植區(qū)開展根結線蟲病病害調查及病原鑒定,以確定根結線蟲種類及分布,以期為科學指導防控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

顯微鏡(Leica DM 2000);PCR儀(Applied Biosystems 2720型);電子天平(先行者);超低溫冷凍儲存箱(DM-HL 398 S型、DM-HL 528 S型,中科美菱生產(chǎn));標準檢驗篩;移液槍;凝膠成像儀(LG 2020型,杭州朗基科學儀器有限公司生產(chǎn));LX-100手掌型離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司).

1.1.2 主要試劑

10×PCR Buffer(Mg2+,free);25 mmol/L MgCl2、Tap酶;dNTPs;蛋白酶K (20 mg/mL);DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒;DL 200 DNA MarKer;6×Loading Buffer.

1.2 根結線蟲樣本采集與保存

2021年9月8日至14日,昆明市煙草技術中心集中采集109個根結線蟲病害樣本.采集地點主要是昆明市8縣(市、區(qū))的主要種植區(qū),以煙站為單位,根據(jù)面積大小每個煙站取1～3個樣本,對樣本進行編號,取根部于自封袋中 4 ℃ 保存(表1).

表1 煙草根結線蟲病樣本信息

1.3 根結線蟲種類鑒定

1.3.1 根結線蟲各蟲態(tài)的收集

1)雌成蟲收集

將患根結線蟲病煙株根部用水沖洗干凈,采用直接解剖法獲取雌成蟲[9].在體視鏡下,用鑷子固定好根,再輕輕挑起根結外部組織,直到雌蟲外部植物組織處理干凈為止,然后在雌蟲的一側由底部慢慢挑起成熟飽滿的雌蟲,一部分用于分子鑒定,另一部分用于會陰花紋鑒定及測量.

2)卵塊及2齡幼蟲的收集

在體視鏡下,直接從根結中挑取乳白色、透明、粘狀物的卵塊堆積物,獲得的卵塊放入 10 mL 離心管中,加入適量清水,在室溫或 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中孵化.

1.3.2 土壤中2齡幼蟲的收集及計數(shù)

使用淺盤法分離土壤中2齡幼蟲:取干凈盆篩,在篩上鋪面巾紙,稱取 100 g 土壤平鋪于紙上,向盆中注入適量清水,水量以剛浸濕土壤為宜,水平靜置 48 h 后,用上層100目、下層500目的套篩沖洗盆底的線蟲懸浮液,收集500目篩上的2齡幼蟲至直徑約為 6 cm 的培養(yǎng)皿中,水平靜置過夜后計數(shù).

1.3.3 根結線蟲形態(tài)學鑒定

雌成蟲會陰花紋鑒定具體步驟參考徐興陽等[10]的方法,具體步驟如下:

1)在雌成蟲收集中選出成熟飽滿的雌蟲,放入干凈的并滴有45%乳酸的有機玻璃板上;

2)在解剖鏡下,用解剖刀切取含有會陰花紋的角質膜,并在乳酸中用柔軟的纖維刷輕輕刷洗角質膜上黏附的組織,清洗干凈;

3)取干凈的載玻片,以甘油作為浮載劑,于顯微鏡下觀察并拍照記錄.

雌成蟲形態(tài)測量方法:把制作好撥片放入LEICA顯微鏡下于LASAF軟件下進行測量,每個種群至少測量20頭雌成蟲[11].具體測量指標見表2.

2齡幼蟲形態(tài)測量方法:將2齡幼蟲置于63～65 ℃ 的水浴鍋中水浴2～3 min 殺死后,用4%甲醛溶液固定保存[12],用于形態(tài)指標測量,具體指標見表2.

表2 形態(tài)測量指標及符號

表3 PCR擴增反應試劑及用量 μL

使用Excel 2016統(tǒng)計并計算各個測量指標,最終以“平均值±標準差(最小值-最大值)”的形式表述.

1.3.4 根結線蟲分子生物學鑒定

DNA提取參照Adam等[13]的方法,略微改進,具體步驟如下:

1)完成滅菌的PCR管加入 5 μL ddH2O;

2)挑選其成熟的雌成蟲放入PCR管中;

3)用滅菌槍頭將蟲體刺破;

4)加入 5 μL 的細胞裂解液(1 μL 10×PCR Buffer(Mg2+,free)、0.8 μL MgCl2、0.05 μL 蛋白酶K、3.15 μL ddH2O,放入液氮中冷凍 20 min,加入 10 μL 液狀石蠟,短暫離心,置于PCR儀中 56 ℃ 反應 80 min,95 ℃ 反應 15 min,得到根結線蟲DNA提取液.

rDNA-ITS區(qū)、mtDNA-COI區(qū)序列進行擴增,具體方法如下:

根據(jù)形態(tài)鑒定出本次實驗主要種群,由此采用特異引物進行擴增反應,反應體系、引物和反應程序分別為表3、表4和表5.PCR反應完成后,用 5 μL 的擴增產(chǎn)物與 1 μL 6×DNA Loading buffer混合,注入1.2%的瓊脂糖凝膠孔中,110 V、180 mA 條件下電泳 30 min,使用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照.

表4 所用引物信息

表5 PCR反應程序

2 結果與分析

2.1 昆明產(chǎn)區(qū)土壤中2齡幼蟲數(shù)量統(tǒng)計

從表6可知,各地區(qū)土壤中根結線蟲2齡幼蟲數(shù)量按以下順序依次降低:嵩明、尋甸、石林、祿勸、富民、晉寧、宜良、安寧.其中嵩明產(chǎn)區(qū)土壤中2齡幼蟲數(shù)量最多,高達每 100 g 土壤中585.90頭.

表6 各縣(市、區(qū))土壤樣本中2齡幼蟲的平均數(shù)量 頭/(100 g土壤)

2.2 煙草根結線蟲形態(tài)學鑒定

經(jīng)形態(tài)學分析，昆明煙區(qū)發(fā)生根結線蟲主要有南方根結線蟲、花生根結線蟲、爪哇根結線蟲和未知根結線蟲，其線蟲種類間具有復合侵染特征.在109個樣品中，檢出存在南方根結線蟲樣本占89.0%，花生根結線蟲占41.3%，爪哇根結線蟲占53.2%，未知線蟲占12.8%.可見昆明產(chǎn)區(qū)危害煙草根結線蟲的種類以南方根結線蟲為主，爪哇根結線蟲和花生根結線蟲次之.

2.2.1 煙草根結線蟲形態(tài)特征及種類描述

根結線蟲各個種之間存在著細微的差別，此差別可以成為重要的鑒定依據(jù)，3種根結線蟲形態(tài)特征描述及比較列于表7.

表7 根結線蟲形態(tài)特征描述及比較

(a)2齡幼蟲

(b)2齡幼蟲頭部

(c)齡幼蟲尾部

(d)雌蟲

(e)雌蟲頭部

(a)2齡幼蟲

(b)2齡幼蟲頭部

(c)齡幼蟲尾部

(d)雌蟲

(e)雌蟲頭部

(a)2齡幼蟲

(b)2齡幼蟲頭部

(c)齡幼蟲尾部

(d)雌蟲

(e)雌蟲頭部

2.2.2 會陰花紋形態(tài)特征

會陰花紋是品種鑒別的一個重要指標，3種不同的根結線蟲進行了描述和對比列于表8.

表8 會陰花紋特征描述及比較

(a)花生根結線蟲 (b)南方根結線蟲 (c)爪哇根結線蟲圖4 根結線蟲雌成蟲會陰花紋

對2齡幼蟲及雌成蟲進行測量后統(tǒng)計2齡幼蟲測量值(表9)，及雌成蟲的測量值(表10)，并進行比較.結果表明其測量數(shù)據(jù)與趙洪海等[11]描述基本相符.

表9 昆明產(chǎn)區(qū)煙草根結線蟲2齡幼蟲形態(tài)指標 μm

續(xù)表9 μm

表10 昆明產(chǎn)區(qū)煙草根結線蟲雌成蟲形態(tài)指標 μm

2.3 昆明產(chǎn)區(qū)煙草根結線蟲混合侵染結果及分析

由表11可知，昆明產(chǎn)區(qū)主要的根結線蟲有3個種，組成的混合侵染有4種類型，混合侵染樣品占樣本總數(shù)比例分別是12.8%、49.5%、17.4%和11.9%，合計達到91.6%.可見在4種混合侵染中南方根結線蟲/爪哇根結線蟲混合侵染比重最大，其余種類復合侵染比重相對較少.

表11 昆明產(chǎn)區(qū)煙草根結線蟲混合侵染形態(tài)鑒定結果

2.4 分子生物學鑒定分析

應用SCAR技術進行根結線蟲DNA 的PCR擴增.南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲目的條帶分別約為 1 200，420，700 bp(圖5、圖6、圖7).

圖5 南方根結線蟲PCR擴增片段電泳圖

圖6 花生根結線蟲PCR擴增片段電泳圖

圖7 爪哇根結線蟲PCR擴增片段電泳圖

2.5 昆明產(chǎn)區(qū)煙草根結線蟲主要種類分布

通過形態(tài)學和分子生物學技術結合，本次在昆明8縣(市、區(qū))采集的109個標本中鑒定出3種根結線蟲，分別是南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲，它們在所調查的縣(市、區(qū))均有發(fā)現(xiàn)，具體分布及混合種群的情況詳見表12、表13.

表12 根結線蟲侵染樣品數(shù)(包括混合侵染)分布

表13 根結線蟲混合侵染檢測樣品數(shù)分布

3 討論

通過形態(tài)學、分子生物學鑒定方法對昆明8縣(市、區(qū))煙草根結線蟲種類進行鑒定，109個病害樣品共鑒定出：南方根結線蟲97份占比89.0%，花生根結線蟲45份占比41.3%，爪哇根結線蟲58份占比53.2%，未知種14份占12.8%，混合侵染南方根結線蟲與花生根結線蟲樣本占比12.8%，南方根結線蟲與爪哇根結線蟲混合侵染樣品占比49.5%，花生與爪哇根結線蟲混合侵染樣品占比17.4%，南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲混合侵染樣品占比11.9%.通過以上數(shù)據(jù)可以看出南方根結線蟲為優(yōu)勢種，其次是爪哇根結線蟲和花生根結線蟲.

4種主要根結線蟲[6]在我國均有發(fā)現(xiàn)，但北方根結線蟲只在較為寒冷地區(qū)，如在貴州、河南等地有所發(fā)現(xiàn)[14，15].2016年在臨滄、玉溪、曲靖、文山及云南省1997年分別檢出了南方根結線蟲、花生根結線蟲、爪哇根結線蟲，以花生根結線蟲為主要病原，并對其進行了研究[9].1998年喻盛甫等研究發(fā)現(xiàn)，在云南省煙草根結線蟲的優(yōu)勢種群由南方根結線蟲轉變?yōu)榛ㄉY線蟲[16].1998年在河南、湖北和四川[17]和2013年在昆明主要縣(區(qū)、市)[3]，同時檢測出南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲，其中南方根結線蟲為優(yōu)勢種群.

喻盛甫等1998年研究發(fā)現(xiàn)云南省煙草根結線蟲主要群體從南方根結線蟲向花生根結線蟲轉移[16].徐興陽等2013年研究發(fā)現(xiàn)昆明主要縣區(qū)煙草根結線蟲優(yōu)勢種群為南方根結線蟲[3]，1998年—2013年15年時間中，昆明產(chǎn)區(qū)煙草根結線蟲優(yōu)勢種群為南方根結線蟲，預示著品種布局的變化可能是改變昆明煙草主產(chǎn)區(qū)根結線蟲優(yōu)勢種群的重要因子.本次實驗得出南方根結線蟲占比高達89.0%，根據(jù)南方根結線蟲的為害特性，根結線蟲病可能將對昆明煙草的產(chǎn)量、質量及生態(tài)環(huán)境、經(jīng)濟收益造成重大影響.

1991年張紹升發(fā)現(xiàn)同一株由多種根結線蟲共同侵染的煙草病株[18]；2017年徐興陽等對昆明市主要煙區(qū)進行根結線蟲初步鑒定中發(fā)現(xiàn)混合侵染占11.54%，主要為花生根結線蟲和爪哇根結線蟲混合侵染[19]；楊艷梅等[20]在昆明、曲靖和玉溪的主要煙區(qū)調查發(fā)現(xiàn)調查樣本中混合侵染達到40.75%.本次調查也發(fā)現(xiàn)混合侵染存在，總和達到了91.6%.這和以往的研究報到總體相符，但混合侵染占比有了明顯增加.這一結果或許預示著，煙草下一步的育種目標中應考慮抗多種根結線蟲煙草品種的培育，在現(xiàn)階段的生產(chǎn)實踐中應加強對混合侵染的預防和關注.

4 結論

通過形態(tài)學及分子生物學鑒定，明確了危害昆明8縣(市、區(qū))煙草的根結線蟲有：南方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲，占比分別是89.0%、41.3%和53.2%，未知種占12.8%.混合侵染種類為：南方根結線蟲與花生根結線蟲，南方根結線蟲與爪哇根結線蟲，花生根結線蟲與爪哇根結線蟲，南方根結線蟲、花生根結線蟲與爪哇根結線蟲，占比分別是12.8%，49.5%，17.4%和11.9%.