2種生防菌對(duì)蘋果樹3種病害病原菌拮抗作用比較

許圓圓　寧娜　李發(fā)康　李培　姚杰　薛應(yīng)鈺

摘要：以生防放線菌長枝木霉T6和放線菌ZZ-9為試材，采用圓盤濾膜法和對(duì)口培養(yǎng)法比較T6、ZZ-9所產(chǎn)生的代謝物對(duì)蘋果樹腐爛病病菌、蘋果樹輪紋病病菌和蘋果樹早期落葉病病菌的拮抗作用，結(jié)果表明：長枝木霉T6的非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)這3種病原菌抑制效果明顯，抑制率分別達(dá)到97.50%、83.69%、68.35%。放線菌ZZ-9的非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病菌和蘋果樹輪紋病菌的抑制率達(dá)到了96.25%和72.42%%，對(duì)早期落葉病菌的拮抗作用較弱，抑制率小于50%。長枝木霉T6和放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)這3種病原菌的拮抗作用不明顯，抑制率均小于50%。長枝木霉T6和放線菌ZZ-9對(duì)蘋果樹三種病害的拮抗作用主要由二者所產(chǎn)生的非揮發(fā)性物質(zhì)起作用。

關(guān)鍵詞：蘋果樹；長枝木霉T6；放線菌ZZ-9；腐爛病菌；輪紋病菌；早期落葉病菌；拮抗；非揮發(fā)性物質(zhì)；揮發(fā)性物質(zhì)

中圖分類號(hào)：S436.611.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2018）11-0024-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.008

Comparison of Antagonistic Effects of Two Biocontrol Bacteria on Three Disease Pathogens in Apple Trees

XU Yuanyuan 1， 2， NING Nan 1， 2， LI Fakang 1， 2， LI Pei 1， 2， YAO Jie 1， 2， XUE Yingyu 1， 2

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China； 2. Laboratory of Biological Control of Crop Diseases and Pests， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：With Trichoderma longibrachiatum T6 and actinomycete ZZ-9 as test materials， the disc filter method and the counterculture method were used to compare antagonistic effects of the metabolites produced by the two biocontrol bacteria to the pathogens of valsa mali， apple white rot and Alternaria mali to provide a basis for spatial distribution of pesticides when these two biocontrol bacteria are used as biocontrol agents to control apple tree diseases. The results showed that the non-volatile substances of Trichoderma longibrachiatum T6 inhibited the three pathogens significantly， and the inhibition rates reached 97.50%， 83.69% and 68.35%， respectively. The inhibitory rate of non-volatile substances of actinomycete ZZ-9 against valsa mali and apple white rot reached 96.25% and 72.42%%， and the antagonism of Alternaria mali was weak， and the inhibition rate was less than 50%； The antagonism of the volatile substances of Trichoderma longibrachiatum T6 and actinomycete ZZ-9 on these three pathogens was not obvious， and the inhibition rate was less than 50%. It is concluded that the antagonistic effects of Trichoderma longiflorum T6 and actinomycete ZZ-9 on three diseases of apple trees mainly play a role in the non-volatile substances produced by the two fungi，which provides important theoretical basis for the development of related preparations in the later stage.

Key words： Apple tree； Trichoderma longibrachiatum T6； Actinomycete ZZ-9； Rotten pathogen； Rhizoctonia； Early deciduous fungus； Antagonism； Non-volatile substances； Volatile substances

蘋果產(chǎn)業(yè)是甘肅省的重要產(chǎn)業(yè)之一[1 - 2 ]，蘋果樹病害的廣泛發(fā)生是阻礙這一產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的重要因素[3 - 4 ]。蘋果樹病害主要有枝干病害、果實(shí)病害和葉部病害。蘋果樹腐爛病和蘋果輪紋病這2種病害既危害枝干，又侵染果實(shí)，病原屬弱寄生菌，具有潛伏侵染特點(diǎn)。蘋果樹腐爛病病原菌是一種弱寄生菌，對(duì)于樹勢(shì)強(qiáng)的樹體其侵染后病原菌不易擴(kuò)展，腐爛病發(fā)生不嚴(yán)重。當(dāng)樹勢(shì)變?nèi)鯐r(shí)，其擴(kuò)展的能力將變強(qiáng)，從而易于發(fā)病，且樹齡越大侵染和擴(kuò)展將越容易[5 ]。蘋果樹腐爛病病原菌生長頑固、反復(fù)，對(duì)果園有強(qiáng)烈的毀滅性，該病已成為蘋果產(chǎn)業(yè)的重要病害之一。蘋果樹輪紋病病原菌不但為害枝干，而且是果實(shí)上的重要病原菌。其為害枝干時(shí)造成枝干上氣孔周圍產(chǎn)生瘤狀斑，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)枝干樹皮變粗糙，最終致使枝干死亡。當(dāng)其為害果實(shí)時(shí)，造成輪紋爛果。已有研究表明，蘋果樹輪紋病菌1a有2個(gè)孢子孔口散發(fā)高峰期，這2個(gè)時(shí)期是防治該病的重要時(shí) 期[6 ]。蘋果樹早期落葉病菌侵染蘋果樹葉片，其危害一是導(dǎo)致葉片脫落，使蘋果生長受到抑制，商品率下降；二是由于葉片大量脫落，花芽的分化受到影響，使來年的坐果率下降，影響來年的蘋果產(chǎn)量；三是由于葉片是樹體產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，葉片生長不良使樹勢(shì)下降，進(jìn)而引起蘋果上其他病害的發(fā)生[7 - 8 ]。在蘋果樹病害的防治中，化學(xué)方法防治有作用迅速、方便和防治效果顯著的特點(diǎn)。在現(xiàn)代果園的日常維護(hù)中，化學(xué)防治是蘋果樹病害防治中最為常用的方法之一[9 ]。但化學(xué)藥劑的長期、大量使用，導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生，同時(shí)造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問題。為此尋找抗性風(fēng)險(xiǎn)低且環(huán)境相容性好的生防制劑已是農(nóng)藥開發(fā)的重要途徑[10 ]，研制出高效的生防制劑來防治蘋果樹病害將從根本上解決問題[11 ]。

木霉是一種主要分布在土壤中的寄生真菌，對(duì)很多病原菌均有良好的抑制作用，且有改良土壤、誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)的功效[12 ]。木霉主要是通過重寄生、分泌胞外降解酶和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物等拮抗作用，抑制病原菌生長[13 ]。有研究表明，長枝木霉T6的抑菌物質(zhì)主要為鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、油酸、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（MEHP）和芥酸酰胺，其制備的發(fā)酵液在日光和紫外光照下穩(wěn)定，不易分解，其儲(chǔ)藏溫度沒有嚴(yán)格限制[14 ]。景芳等[15 ]通過優(yōu)化培養(yǎng)基和篩選助劑類型，研制出了長枝木霉T6水分散粒劑，這為長枝木霉T6應(yīng)用于生產(chǎn)提供了重要依據(jù)。放線菌同樣為一種分布廣泛的微生物，其在土壤和生物體內(nèi)都有分布，且其對(duì)環(huán)境兼容性好，對(duì)植物病害病原菌有良好抑制作用的同時(shí)對(duì)植物體低毒。薛應(yīng)鈺等[16 ]對(duì)分離自土壤中的放線菌進(jìn)行篩選，得到了放線菌ZZ-9發(fā)酵液，對(duì)蘋果樹腐爛病菌有明顯抑制作用，抑制率達(dá)到96.4%，并初步鑒定放線菌ZZ-9為婁徹氏鏈霉菌。已有研究表明，長枝木霉T6和放線菌ZZ-9這兩種生防菌的抗菌物質(zhì)對(duì)于環(huán)境有著良好的穩(wěn)定性[17 - 18 ] ，這就意味著這兩種菌都有良好的藥物開發(fā)潛質(zhì)。

我們通過比較長枝木霉T6和放線菌ZZ-9的非揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病菌、蘋果樹輪紋病菌和蘋果樹早期落葉病菌的拮抗作用，以期為這2種生防菌作為生防藥劑在蘋果樹上的施藥分布提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 長枝木霉T6、放線菌ZZ-9、蘋果樹腐爛病菌、蘋果樹輪紋病菌、蘋果樹早期落葉病菌的菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂18 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 2種生防菌非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)3種病原菌拮抗作用比較 長枝木霉T6、放線菌ZZ-9的非揮發(fā)性物質(zhì)拮抗作用測定均采用圓盤濾膜法[19 ]。在PDA平板表面平貼1層滅過菌的玻璃紙后接入長枝木霉T6菌餅（d=0.50 cm）；放線菌ZZ-9則是在貼有1層滅過菌的玻璃紙的PDA平板上劃線接入，縱橫各7條。28 ℃恒溫光照條件下培養(yǎng)3 d后將玻璃紙去除，接入蘋果樹腐爛病菌（蘋果樹輪紋病菌和蘋果樹早期落葉病菌按同樣方法接入），每組處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。以不接長枝木霉T6為對(duì)照。每組設(shè)3次重復(fù)。于培養(yǎng)3 d和5 d時(shí)測量記錄菌落直徑并計(jì)算抑制率。抑制率計(jì)算公式如下：

抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（處理菌落直徑-5 mm）]×100%

1.2.2 2種生防菌揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)3種病原菌拮抗作用比較 長枝木霉T6和放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)拮抗作用測定采用對(duì)口培養(yǎng)法[20 ]。在PDA平板上轉(zhuǎn)接長枝木霉T6菌餅（d=0.50 cm）。放線菌ZZ-9則是在PDA平板上劃線接入，縱橫各7條。28 ℃恒溫?zé)o光條件下培養(yǎng)5 d后將滅菌的玻璃紙平鋪于菌落表面，另一PDA平板接入蘋果樹腐爛病菌（蘋果樹輪紋病菌和蘋果樹早期落葉病菌相同方法接入），將兩平板皿底對(duì)接，用封口膜封口，以不接長枝木霉T6的對(duì)口平板為對(duì)照。每組3次重復(fù)。于培養(yǎng)3 d和5 d測量并記錄菌落直徑并計(jì)算抑制率，計(jì)算公式同1.2.1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2010進(jìn)行整理，利用DPS7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種生防菌的非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹3種病原菌的拮抗作用

2.1.1 對(duì)蘋果樹腐爛病菌的拮抗作用 從表1、圖1可知，長枝木霉T6與放線菌ZZ-9對(duì)蘋果樹腐爛病菌均具有明顯的拮抗作用，2種生防菌的非揮發(fā)性性物質(zhì)在3 d和5 d時(shí)抑制率均高于95%。方差分析表明，2種生防菌的非揮發(fā)性物質(zhì)在3 d和5 d時(shí)對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制效果均較CK存在極顯著差異，但二者的拮抗效果均無明顯差異。

2.1.2 對(duì)蘋果輪紋病菌的拮抗作用 從表2、圖2可知，長枝木霉T6和放線菌ZZ-9菌株對(duì)蘋果樹輪紋病菌均有明顯拮抗作用，2種生防菌的非揮發(fā)性物質(zhì)在3 d時(shí)抑制率分別為97.81%和90.63%，5 d時(shí)抑制率分別達(dá)到83.69%和72.42%。方差分析表明，2種生防菌的非揮發(fā)性物對(duì)蘋果樹輪紋病菌的抑制效果均較CK存在極顯著差異，且長枝木霉T6對(duì)該病原菌的拮抗效果優(yōu)于放線菌ZZ-9。

2.1.3 對(duì)蘋果早期落葉病菌的拮抗作用 從表3、圖3可知，長枝木霉T6對(duì)蘋果樹早期落葉病菌的拮抗作用強(qiáng)于放線菌ZZ-9對(duì)該菌的拮抗作用，2種生防菌的非揮發(fā)性物質(zhì)在3 d時(shí)的抑菌率均大于5 d時(shí)的抑菌率，5 d時(shí)放線菌ZZ-9對(duì)蘋果樹早期落葉病菌的抑制率小于50%。方差分析結(jié)果表明，長枝木霉T6和放線菌ZZ-9對(duì)蘋果樹早期落葉病菌的抑制效果均較CK差異極顯著，且長枝木霉T6對(duì)該病原菌的拮抗效果優(yōu)于放線菌ZZ-9。

2.2 2種生防菌的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹上3種病原菌的拮抗作用

2.2.1 對(duì)蘋果樹腐爛病菌的拮抗作用 表4、圖4表明，長枝木霉T6的揮發(fā)性物質(zhì)與放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制率均小于50%。3 d時(shí)長枝木霉T6的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制率達(dá)到40.36%，5 d時(shí)抑制率只有18.33%；放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制率3 d時(shí)為17.94%，5 d時(shí)僅為4.28%。方差分析結(jié)果表明，放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制效果較CK無顯著性差異，長枝木霉T6的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制效果較CK有極顯著差異，且長枝木霉T6的拮抗效果優(yōu)于放線菌ZZ-9。

2.2.2 對(duì)蘋果輪紋病菌的拮抗作用 從表5、圖5可以看出，2種生防菌的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果輪紋病病原菌的拮抗作用均不明顯，3 d時(shí)放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果輪紋病病原菌的抑制率為32.18%，長枝木霉T6的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果輪紋病病原菌抑制率為17.81%；5 d時(shí)2種生防菌的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果輪紋病病原菌的抑制率均在20%以上。方差分析結(jié)果表明，長枝木霉T6的揮發(fā)性物質(zhì)與放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果輪紋病病原菌的抑制效果均較CK差異極顯著，且長枝木霉T6的拮抗效果在3 d時(shí)優(yōu)于放線菌ZZ-9，5 d 時(shí)與放線菌ZZ-9無明顯差異。

2.2.3 對(duì)蘋果早期落葉病菌的拮抗作用 試驗(yàn)結(jié)果（表6，圖6）表明，2種生防菌的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹早期落葉病菌病原菌均無拮抗作用。3 d時(shí)長枝木霉T6的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制率為5.61%，5 d時(shí)抑制率為-1.25%；放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制率3 d時(shí)為0.56%，5 d時(shí)僅為2.92%。方差分析結(jié)果表明，長枝木霉T6的揮發(fā)性物質(zhì)和放線菌ZZ-9的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹腐爛病病原菌的抑制效果均與CK無顯著差異且二者的拮抗效果也無明顯差異。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)表明，放線菌ZZ-9的2種物質(zhì)對(duì)蘋果樹早期落葉病菌無明顯拮抗作用，而長枝木霉T6的非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)該病原菌有明顯拮抗作用，在生產(chǎn)中長枝木霉T6可用于早期落葉病的防治。長枝木霉T6與放線菌ZZ-9對(duì)枝干病害病原菌有明顯拮抗作用，且長枝木霉的拮抗效果要優(yōu)于放線菌ZZ-9的拮抗效果。但2種抑菌物質(zhì)相混合是否可增強(qiáng)其拮抗作用有待進(jìn)一步研究。武漢琴等[21 ]研究表明，長枝木霉可生長在茶樹上，且對(duì)茶樹的生長有一定的促生作用，人工接種后可在新苗上再分離出這種菌，在植物體內(nèi)定植后，其外界環(huán)境對(duì)它的影響減弱，更利于其藥效的發(fā)揮?；诒驹囼?yàn)長枝木霉T6對(duì)蘋果樹上3種病原菌較好的拮抗效果，是否可將長枝木霉T6菌株接到蘋果樹上，利用其自身生長及其所產(chǎn)生的代謝物來抑制蘋果樹上的病原菌生長，以及接入長枝木霉T6后是否會(huì)對(duì)蘋果樹產(chǎn)生不良影響，這有待進(jìn)一步研究。放線菌ZZ-9有良好的穩(wěn)定性，有應(yīng)用于生產(chǎn)的良好條件，但其抑菌物質(zhì)尚不明確。在范萬澤等[22 ]研究放線菌ZZ-9發(fā)酵液的抑菌普時(shí)，得到放線菌ZZ-9的發(fā)酵液對(duì)蘋果樹輪紋病菌的抑制率小于27%，而本試驗(yàn)通過圓盤濾膜法得到其非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果樹輪紋病菌的抑制率大于70%。這是否是方法不同而造成的抑菌物質(zhì)濃度差異有待進(jìn)一步研究。2種生防菌的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)蘋果輪紋病菌有拮抗作用，但其拮抗作用不明顯，若改變其濃度是否可提高其拮抗效果有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)僅2種生防菌對(duì)這3種病原菌在實(shí)驗(yàn)室的拮抗效果，田間試驗(yàn)如何，有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] 慕鈺文，馮毓琴，張永茂，等. 隴東地區(qū)蘋果矮砧密植栽培現(xiàn)狀及發(fā)展建議[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2017（4）：62-65.

[2] 黃耀龍. 甘肅中部地區(qū)蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及建議[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2017（12）：89-91.

[3] 王軍林，竇云萍，王春良. 套袋對(duì)寧夏引黃灌區(qū)紅富士蘋果果實(shí)品質(zhì)和農(nóng)藥殘留的影響[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2017（5）：36-39.

[4] 張軍紅，秦 敏. 延安蘋果產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2016（5）：79-83.

[5] 國立耘，李保華，李保華，等. 中國蘋果樹腐爛病發(fā)生和防治情況調(diào)查[J]. 植物保護(hù)，2009，35（2）：114-116.

[6] 王紅旗，朱世宏，謝文強(qiáng)，等. 對(duì)付蘋果樹輪紋病有了好方法[N]. 河北科技報(bào)，2009-09-15（3）.

[7] 路世云，路 華. 蘋果樹早期落葉原因與防治[J]. 落葉果樹，2011（3）：55-57.

[8] 曉 利，嚴(yán)惠萍，趙小弟. 蘋果樹早期落葉病防治要得“竅”[J]. 綠色植保，2016（7）：20.

[9] 楊李娟. 淺析蘋果樹的病害防治對(duì)策和措施[J]. 現(xiàn)代園藝，2011（19）：46；48.

[10] 牛鑫斌，徐秉良，劉 佳，等. 長枝木霉T6水分散粒劑對(duì)3種植物病害的生防效果[J]. 2018，53（1）：90-94.

[11] 李 陽，宋素琴，王 靜，等. 蘋果樹腐爛病的防治研究進(jìn)展[J]. 北方園藝，2015（13）：194-197.

[12] 常 媛，楊興堂，姜傳英，等. 一株拮抗3種土傳病害病原菌的長枝木霉[J]. 草業(yè)科學(xué)，2017，34（2）：246-254.

[13] 甘 林，代玉立，楊秀娟，等.木霉菌對(duì)番茄病菌的抑制作用[J] . 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31（11）：1221-1225.

[14] 張建華. 長枝木霉T6發(fā)酵條件優(yōu)化，抑菌活性成分分析及其殺線作用測定[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：10-13.

[15] 景 芳，徐秉良，梁巧蘭，等. 長枝木霉Trichoderma longibrachiatum T6水分散粒劑的研制[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18（2）：241-248.

[16] 薛應(yīng)鈺，范萬澤，張樹武，等. 蘋果樹腐爛病菌拮抗放線菌的篩選、鑒定及防效[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，27（10）：3379-3386.

[17] 張建華，徐秉良，鄭宇宇，等. 長枝木霉T6發(fā)酵液穩(wěn)定性及粗提物抑菌活性[J]. 2015，54（5）：330-333.

[18] 范萬澤，薛應(yīng)鈺，張樹武，等. 拮抗放線菌ZZ-9菌株發(fā)酵液的抑菌普及穩(wěn)定性測定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，26（3）：463-470.

[19] 梁巧蘭，王 芳，魏列新，等. 深綠木霉T2菌株對(duì)百合疫霉拮抗作用及機(jī)制[J]. 植物保護(hù)，2011，37（60）：164-167.

[20] 鐘小燕，梁妙芬，甄錫狀，等. 木霉菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑制作用[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2009（26）：186-189.

[21] 武漢琴，蘇經(jīng)遷，謝明英，等. 茶樹內(nèi)生木霉的鑒定及其在在植物體內(nèi)的定植[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2009，

28（3）：342-348.

[22] 范萬澤，薛應(yīng)鈺，張樹武，等. 拮抗放線菌ZZ-9菌株發(fā)酵液的抑菌普及穩(wěn)定性測定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，26（3）：463-470.

（本文責(zé)編：鄭立龍）