莧菜amaARF6基因克隆及其外源激素處理下在幼苗中響應(yīng)分析

潘君飛，彭麗云，趙春麗，王 曉，張梓浩，陳裕坤，賴鐘雄，劉生財

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福州 350002）

ARFs（Auxin response factors）是重要生長素響應(yīng)因子，其編碼蛋白質(zhì)可與生長素響應(yīng)基因啟動子特定響應(yīng)元件結(jié)合，在植物器官不同發(fā)育時期表達調(diào)控，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程[1-2]。李惠華等研究發(fā)現(xiàn) DlARF1、DlARF3、DlARF4、DlARF6、DlARF8、DlARF10、DlARF16和DlARF17在龍眼體胚發(fā)育各階段均有表達[3-4]。植物激素和外界環(huán)境因子對ARF基因功能發(fā)揮重要調(diào)控作用。Tian等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtARF8受光誘導(dǎo)[5]，林麗霞等研究發(fā)現(xiàn)外源生長素IAA上調(diào)龍眼DlARF5a表達[6]。ARF6作為ARF基因家族一員，在其他高等植物中研究較少。唐雨微發(fā)現(xiàn)番茄SlARF6在莖和盛花期表達水平較高，SlARF6基因參與果實形成和發(fā)育過程[7]。此外，王飛燕等發(fā)現(xiàn)SlARF6明顯受GA3和2,4-D等外源激素負調(diào)控[8]。

莧菜（Amaranthus tricolor L.）屬石竹目莧科莧屬植物，具有營養(yǎng)和藥用價值[9]，是甜菜色素提取重要原料[10]。甜菜色素是抗氧化能力較強的天然植物色素。外源激素可影響植物生長發(fā)育，調(diào)控次生代謝產(chǎn)物代謝過程[11]。ARF6基因受多種激素調(diào)控，影響植物生長發(fā)育[12]。但有關(guān)ARF6是否響應(yīng)外源激素并影響植物幼苗生長研究尚未見報道。因此，本研究根據(jù)莧菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫克隆1個莧菜生長素應(yīng)答因子家族成員amaARF6，分析外源激素對莧菜幼苗處理下，amaARF6基因表達特征及其與莧菜形態(tài)間關(guān)系，旨在為研究amaARF6基因?qū)η{菜幼苗生長和甜菜紅素合成調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究莧菜材料為‘大紅’花葉莧菜，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。處理后莧菜材料取樣，液氮速凍并保存于-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 莧菜總RNA提取及cDNA合成

多糖多酚總RNA提取試劑盒（購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取莧菜幼苗總RNA，Gene RacerTM試劑盒和SYBR Ex ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄為cDNA分別用于基因克隆和定量PCR分析。

1.2.2 amaARF6基因克隆

根據(jù)莧菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（SRA：SSR924089～SSR924092），查找amaARF6基因序列片段，與NCBI登錄甜菜BvARF6基因序列比對，找出保守區(qū)，利用Primer5.0根據(jù)保守區(qū)設(shè)計3'-RACE和5'-RACE特異引物（見表1），以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板作巢式PCR反應(yīng)，擴增3'和5'末端序列。利用DNAMAN將所得序列片段拼接獲得amaARF6基因cDNA全長，設(shè)計ORF引物驗證（見表1）。

按TaKaRa LA Taq說明書作PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54～56℃退火30 s，72℃延伸1～3 min（根據(jù)目的片段大小決定），30個循環(huán)，72℃延伸10 min。將目的條帶割膠純化回收，連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取PCR驗證陽性克隆菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

表1 引物序列Table 1 List of primers used

1.2.3 生物信息學(xué)分析

DNAMAN7.0軟件對基因序列片段拼接及氨基酸序列推導(dǎo)；利用在線軟件對該基因編碼蛋白作生物信息學(xué)分析；MEGA5.0軟件Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建不同物種間ARF6蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 外源激素處理

水培法對‘大紅’花葉莧菜作外源激素處理。以MS不添加有機成分為基本營養(yǎng)液并作對照，添加不同濃度IAA，IBA，2,4-D，GA3及PP333等外源激素處理。參照文獻[13]方法，激素質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為IAA：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg · L-1；IBA和2,4-D：0.5，1.0，1.5，2.5 mg· L-1；GA3和PP333：0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mg · L-1。首先在培養(yǎng)皿底部墊3層濾紙，將各處理及對照營養(yǎng)液倒入各培養(yǎng)皿中，直至濾紙完全濕潤，濾紙上均勻播種莧菜種子，每個培養(yǎng)皿30粒，每個處理重復(fù)3次，隨機排列。培養(yǎng)期間添加營養(yǎng)液2次·d-1，參照文獻[14]，培養(yǎng)7 d后莧菜幼苗拍照取樣。

1.2.5 qRT-PCR分析

以EF1a為內(nèi)參基因，根據(jù)克隆amaARF6基因cDNA全長設(shè)計出特異引物（見表1），檢測不同處理下莧菜amaARF6基因表達量。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa），反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，退火時間20 s（溫度根據(jù)引物Tm值適當調(diào)整），72℃延伸12 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，擴增amaARF6基因和內(nèi)參基因，3次重復(fù)?；蛳鄬Ρ磉_量計算參照文獻[14]方法。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2010和DPS 14.10軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莧菜amaARF6基因克隆

以‘大紅’花葉莧菜為材料，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，通過莧菜試管開花過程轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息篩選莧菜amaARF6基因cDNA片段，RACE技術(shù)及ORF驗證作PCR擴增，最終獲得莧菜amaARF6 cDNA全長序列，命名為amaARF6（NCBI登錄號：MG581459）。amaARF6基因全長為3 758 bp，其中5'UTR 679 bp，3'UTR 359 bp，poly A尾長24 bp，該基因開放閱讀框為2 697 bp（見圖1），編碼898個氨基酸。

圖1 莧菜amaARF6基因cDNA全長Fig.1 Full-length amaARF6 cDNA sequence of Amaranthus tricolor L．

2.2 莧菜amaARF6基因生物信息學(xué)分析

利用ProtParam預(yù)測分析莧菜amaARF6基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。結(jié)果顯示，該蛋白分子式為C4447H6892N1244O1363S33，相對分子質(zhì)量為100.65 ku，等電點為5.88，屬于親水但不穩(wěn)定蛋白。根據(jù)NCBICDS在線分析工具分析amaARF6蛋白結(jié)構(gòu)域，該蛋白包括生長素響應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域和生長素功能位點（見圖2）。通過MEME在線分析，莧菜motif與甜菜和擬南芥非常保守，說明本研究獲得ARF6與甜菜、番茄和擬南芥ARF6功能相同（見圖3）。

圖2 NCBI中amaARF6蛋白氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域檢索Fig.2 Search for conserved domain of amaARF6 protein amino acid sequence by NCBI

圖3 與甜菜、番茄和擬南芥ARF6蛋白motif分析Fig.3 Motif analysis with BvARF6,SlARF6 and AtARF6 protein

在線分析工具Signal P4.1 Server預(yù)測莧菜amaARF6蛋白信號肽發(fā)現(xiàn)，該蛋白無明顯信號肽，可能在胞質(zhì)中起作用。

利用在線分析軟件TMpred對莧菜amaARF6蛋白作跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白不屬于跨膜蛋白，亞細胞定位預(yù)測表明該蛋白定位于葉綠體中。利用NetPhos 2.0 Serve在線磷酸化位點分析工具預(yù)測莧菜amaARF6蛋白磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)絲氨酸磷酸化在莧菜amaARF6蛋白中占主導(dǎo)地位（見圖4），推測絲氨酸磷酸化可能在莧菜amaARF6蛋白行使功能中有重要作用。二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明（利用在線分析工具PHD和SWISS-MODEL），amaARF6蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主（見圖5～6）。

圖4 莧菜amaARF6蛋白磷酸化修飾預(yù)測Fig.4 Predicted phosphorylation sites in amino acid sequence of amaARF6

圖5 amaARF6蛋白序列二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of amaARF6

圖6 amaARF6蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Three-dimensional structure prediction of amaARF6

2.3 ARF6基因系統(tǒng)進化樹分析

為分析比較克隆獲得amaARF6基因與其他物種ARF6基因親緣關(guān)系，將擬南芥、甜菜、番茄、玉米等其他11種植物與莧菜amaARF6基因cDNA核酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列作進化樹分析（見圖7）。莧菜amaARF6蛋白與甜菜相似度最高，達100%，莧菜與甜菜同屬為石竹目，說明ARF6蛋白在生物進化過程中保守。此外，莧菜amaARF6蛋白與番茄相似度達98%，說明莧菜amaARF6蛋白與番茄親緣關(guān)系較近。

圖7 ARF6基因系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree for ARF6 gene

2.4 外源激素處理對莧菜生長和amaARF6基因表達影響

2.4.1 不同濃度生長素處理對莧菜生長和amaARF6基因表達影響

在IAA處理莧菜幼苗中，隨IAA濃度升高，amaARF6基因表達量整體呈先升后降趨勢。其中，當IAA濃度為1.5 mg·L-1時，amaARF6基因表達量最高，約為對照表達量3.1倍（見圖8）。在不同濃度IBA處理條件下，amaARF6基因表達量隨IBA濃度升高而逐漸上升，濃度為1.0 mg·L-1時略有下降（見圖8）。在2,4-D處理條件下，莧菜生長明顯受抑制，根系生長受抑制，莖段變短甚至彎曲，甜菜紅素累積也隨2,4-D濃度增加呈下降趨勢（見圖9）；2,4-D處理下amaARF6基因表達量隨2,4-D濃度升高呈先升后降趨勢，當2,4-D濃度為0.5 mg·L-1時，amaARF6基因表達量最高，約為對照5倍（見圖8）。此外，在2,4-D、IAA、IBA3種生長素處理下，amaARF6基因表達均上調(diào)。

2.4.2 不同濃度GA3和PP333處理對莧菜生長和amaARF6基因表達影響

在不同濃度GA3處理條件下，隨GA3濃度提高，莧菜莖段均逐漸伸長，甜菜紅素累積明顯受抑制（見圖10），amaARF6基因表達量呈先降后升再降趨勢變化（見圖11）。PP333處理條件下，莧菜莖段隨濃度升高而變短，甜菜紅素累積呈上升趨勢（見圖10），與GA3處理相反，可能因PP333抑制GA3作用；隨PP333濃度提高，amaARF6基因表達量也整體呈先降后升趨勢（見圖11）。但在GA3和PP333處理下，amaARF6基因表達均發(fā)生下調(diào)，與2,4-D、IAA、IBA三種生長素處理結(jié)果相反。

圖8 amaARF6基因在不同生長素處理下表達趨勢Fig.8 Change of expression of amaARF6 gene under different auxin treatment

圖9 莧菜幼苗在2,4-D處理下生長狀態(tài)Fig.9 Growth status of amaranth seedlings in 2,4-D treatment

圖10 莧菜幼苗在GA3和PP333處理下生長狀態(tài)Fig.10 Growth status of amaranth seedlings in GA3and PP333treatment

圖11 amaARF6基因在GA3和PP333處理下表達趨勢Fig.11 Change of expression of amaARF6 gene under GA3and PP333treatment

3 討論與結(jié)論

3.1 莧菜amaARF6基因功能

本研究克隆獲得1個莧菜ARF6基因，命名為amaARF6。ARF是一個具保守域轉(zhuǎn)錄因子，有明顯序列特征[8]。生物信息學(xué)分析表明，莧菜amaARF6基因與其他ARF6基因有高度同源性，amaARF6蛋白包括生長素響應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域和生長素功能位點，均是ARF基因家族所特有序列特征[15]；通過motif分析，莧菜ARF6 motif與甜菜、番茄和擬南芥motif結(jié)構(gòu)相近，說明該轉(zhuǎn)錄因子功能系統(tǒng)較相似；進化樹分析表明，莧菜amaARF6與甜菜BvARF6蛋白進化距離最近，與其他物種相似性較高。表明新基因amaARF6是莧菜ARF家族基因成員，與其他植物ARF6基因功能相似。

3.2 生長素對amaARF6基因表達影響

植物生長發(fā)育過程受激素調(diào)控，尤其是生長素類物質(zhì)。甜菜色素對不同類型生長素物質(zhì)和濃度響應(yīng)差別較大[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)2,4-D抑制莧菜幼苗生長和甜菜紅素積累，與鄭學(xué)立研究結(jié)果一致[13]。鄭學(xué)立研究發(fā)現(xiàn)2,4-D影響甜菜紅素代謝通路中部分相關(guān)基因表達，影響甜菜色素合成，但機理尚不清楚。本研究通過對莧菜幼苗中amaARF6基因定量表達分析后認為，2,4-D可促進莧菜幼苗中amaARF6基因表達，尤其在低濃度條件下效果更顯著，使幼苗對2,4-D產(chǎn)生響應(yīng)，影響甜菜色素代謝相關(guān)基因表達及甜菜色素代謝。amaARF6基因響應(yīng)方式及是否影響甜菜色素代謝相關(guān)基因表達還需進一步驗證。王飛燕等研究發(fā)現(xiàn)，外源激素2,4-D在一定濃度條件下可抑制番茄果實發(fā)育過程中ARF6表達[8]，與本研究結(jié)果不同，可能是材料遺傳背景差異較大或發(fā)育時期不同導(dǎo)致。

Zhao等研究表明，IAA對鹽地堿蓬愈傷組織色素含量無顯著影響[19]，本研究發(fā)現(xiàn)IAA和IBA對莧菜幼苗生長及甜菜紅素積累無顯著影響。另外，amaARF6積極響應(yīng)IAA和IBA調(diào)控，不同濃度IAA和IBA處理下均在濃度1.0 mg·L-1時輕微抑制。

以上3種生長素處理下，amaARF6基因均存在上調(diào)現(xiàn)象，推測amaARF6基因可能具備ARF家族正調(diào)控因子表達特征和功能，影響不同發(fā)育或代謝過程中相關(guān)基因表達。

3.3 GA3和PP333對amaARF6基因表達和莧菜幼苗生長影響

GA維持黑暗條件下暗形態(tài)建成[20]，可能間接抑制甜菜紅素合成。Kinsman等研究報道，莧菜幼苗中甜菜紅素含量在GA存在條件下減少[16]，與本研究結(jié)果一致。赤霉素信號途徑和生長素運輸相關(guān)[21]。生長素可有效促進赤霉素合成途徑各種相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[22]，同時，赤霉素促進生長素運輸[23]，與本研究GA3處理促進莧菜莖段伸長一致。PP333處理下，莧菜生長、甜菜紅素累積趨勢及amaARF6基因表達量均與GA3相反，因此推測amaARF6基因可能參與調(diào)控莧菜幼苗生長和甜菜紅素合成。唐雨微研究發(fā)現(xiàn)番茄ARF基因家族有SlARF6A和SlARF6B兩個成員[7]，本研究amaARF6基因表達量在GA3和PP333處理下均下調(diào)，因此推測外源激素GA3和PP333處理影響生長素響應(yīng)因子amaARF6其他成員表達，影響內(nèi)源生長素信號傳導(dǎo)莧菜生長及色素合成。amaARF6基因表達與莧菜中甜菜紅素合成關(guān)系尚待深入研究。

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