腐熟堆肥中維素降解菌篩選鑒定及酶學(xué)特性研究

周東興，王廣棟，鄔欣慧， 寧玉翠，李 晶，李 磊，曹 旭

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150030）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量高達(dá)7億t[1]，但利用率僅3%，每年有超過(guò)70%秸稈作為燃料或在田間被直接焚燒，污染環(huán)境。纖維素作為秸稈主要成分，是自然界中數(shù)量最大、分布最廣泛、來(lái)源最豐富的碳水化合物，也是地球上數(shù)量最大可再生資源之一[2]。纖維素具有降解困難、降解率低特性[3-4]，高效、充分利用纖維素成為研究熱點(diǎn)[5-6]。傳統(tǒng)物理、化學(xué)降解成本高，難以大規(guī)模推廣并應(yīng)用。近年開(kāi)發(fā)的新纖維素資源利用技術(shù)，仍存在轉(zhuǎn)化利用率低、時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題[7]。利用微生物產(chǎn)生纖維素酶降解纖維素，具有條件溫和、產(chǎn)物產(chǎn)率高和無(wú)二次污染等特點(diǎn)，成為目前有效且更接近自然生態(tài)的纖維素處理方法[8]。研究者從篩選纖維素酶生產(chǎn)菌[9]和優(yōu)化菌產(chǎn)纖維素酶條件[10]等方面開(kāi)展研究。纖維素酶來(lái)源廣泛，昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物、細(xì)菌、放線菌、真菌等均可產(chǎn)生纖維素酶[11]，發(fā)現(xiàn)高效降解纖維素微生物是研究重點(diǎn)。

堆肥中含有大量纖維素降解微生物，劉曉梅等利用杏鮑菇菌渣分離篩選出高效纖維素菌株為菌渣發(fā)酵腐熟堆肥提供優(yōu)質(zhì)菌種[12]，易旻等從雞糞蘑菇渣高溫堆肥中解淀粉芽孢桿菌[13]，張喜慶從自然發(fā)酵牛糞中篩選一株枯草芽孢桿菌，在堆肥發(fā)酵方面具有較大應(yīng)用潛力[14]。本研究從以牛糞和秸稈為原材料腐熟堆肥中篩選具有較強(qiáng)纖維素降解能力菌株，采用纖維素剛果紅平板識(shí)別、濾紙崩解試驗(yàn)初篩及液體發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩法得到2株產(chǎn)CMC酶活和FPA酶活較高菌株（枯草芽孢桿菌與隱球酵母菌），并以羧甲基纖維素鈉為主要碳源培養(yǎng)基研究其產(chǎn)酶性能，分類鑒定菌株，以期為秸稈快速腐解提供優(yōu)質(zhì)菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

牛糞和秸稈以質(zhì)量1∶1混合發(fā)酵堆肥，供試玉米秸稈和畜禽糞便均取自哈爾濱市周邊養(yǎng)殖戶。玉米秸稈經(jīng)曬干、粉碎，畜禽糞便為牛糞，曬干備用。

表1 堆肥物料基本化學(xué)性質(zhì)Table 1 Chemical properties of compost materials

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純化

取堆肥物10.0 g，無(wú)菌條件下加入裝90 mL無(wú)菌水搖瓶。置于搖床上，30℃下振蕩培養(yǎng)15 min。取上清液5 mL加入45 mL無(wú)菌水中，梯度稀釋成10-1至10-5濃度梯度，常規(guī)劃線法接種于NYD培養(yǎng)基[15]上，30℃恒溫培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)后分離平板菌落計(jì)數(shù)后挑選形態(tài)差異明顯菌落，重復(fù)劃線接種于培養(yǎng)基，直至純化得到單菌落。

1.2.2 纖維素降解菌初篩

采用剛果紅培養(yǎng)基[16]水解圈指標(biāo)對(duì)純化菌株初篩[7]。30℃下于NYD培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h活化菌種，剛果紅培養(yǎng)基上點(diǎn)接菌株，經(jīng)3～4 d培養(yǎng)，分別測(cè)定水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），計(jì)算D/d比值（即HC比值），挑取生長(zhǎng)速度快且HC值較大菌株純化和保種，作為初篩菌株。

1.2.3 纖維素降解菌復(fù)篩

種子培養(yǎng)液配制：將菌種接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基[18]中，置于振蕩培養(yǎng)箱中30℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)2 d，制成種子培養(yǎng)液備用。

粗酶液制備：取3%種子培養(yǎng)液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，三角瓶搖床培養(yǎng)，取定量培養(yǎng)液，4 000 r·min-1下離心20 min上清液即粗酶液，粗酶液應(yīng)馬上使用，若暫時(shí)不用置于4℃冰箱中冷藏，以免失活。

將初篩獲得菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，30℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d，測(cè)其粗酶液CMC酶活和FPA酶活，選出酶活力高產(chǎn)菌株，作為復(fù)篩菌株。

1.2.4 酶活力測(cè)定

CMC酶活、FPA酶活測(cè)定分別參照文獻(xiàn)[19-20]方法。酶活按國(guó)際單位規(guī)定：每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖酶量為一個(gè)酶活力，單位IU。

1.2.5 濾紙崩解試驗(yàn)

移取5 mL粗酶液到濾紙條培養(yǎng)基[21]中，并以不加菌液濾紙條作為對(duì)照，在與初篩溫度相同條件下培養(yǎng)10 d，觀察濾紙條潰爛情況，以“+”表示濾紙崩潰程度，“+”越多說(shuō)明該菌株纖維素降解能力越強(qiáng)[22]。將濾紙條用水輕輕沖洗，60℃烘干至恒重后稱重計(jì)算濾紙失重率[23]。

1.2.6 纖維素降解菌產(chǎn)酶條件研究

①培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株酶活影響。在容積為150 mL三角瓶中，裝入50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別取3%1號(hào)和7號(hào)菌株種子培養(yǎng)液接種于其中，30℃下180 r·min-1搖振培養(yǎng)，分別于12、24、48、72、96、120、144 h取樣測(cè)定 CMC酶活和FPA酶活。

②調(diào)節(jié)初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基pH，研究初始pH對(duì)菌株酶活影響[24]。在容積150 mL三角瓶中，分別裝入50 mL起始pH分別為4.0、4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0液體發(fā)酵培養(yǎng)基，分別取3%1號(hào)和7號(hào)菌株種子培養(yǎng)液接種于不同pH液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃下180 r·min-1搖振培養(yǎng)48 h，取樣測(cè)定CMC酶活和FPA酶活。

1.3 纖維素分解菌鑒定

1.3.1 菌種形態(tài)觀察及生理生化特性

將所獲菌株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)狀況和菌落形態(tài)特征及革蘭氏染色表現(xiàn)，光學(xué)顯微鏡觀察。吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、淀粉水解、明膠水解等主要生理生化特征參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[25]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[26]方法測(cè)定。

1.3.2 菌種分子生物學(xué)鑒定

采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，使用引物7 F（5'CAGAGTT TGATCCTGGCT3'）和 1540 R（5'AGGAGGTGATCC AGCCGCA3'）對(duì)菌株16S rDNA序列擴(kuò)增。酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域基因序列分析以提取酵母菌總DNA為模板，用真菌26S rDNA D1/D2區(qū)通用引物 NL1（NL1∶5'GCATATCAATAAGCGGAAAAG3'）和NL4（5'GGTCCGTGTTTCAAGACG3'）作為上下游引物，擴(kuò)增菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域片段。PCR條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃修復(fù)延伸10min，4℃保存。

獲得PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，將所得序列通過(guò)Blast程序和GenBank核酸數(shù)據(jù)在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落統(tǒng)計(jì)及菌落形態(tài)描述

本試驗(yàn)篩選10株菌落形態(tài)具有明顯特征菌株，觀察其菌落和菌種形態(tài)特征，描述菌落形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 纖維素降解菌分離與篩選

將純化菌株轉(zhuǎn)接至剛果紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑見(jiàn)表3，由表3知，共4株菌產(chǎn)生較為清晰透明圈，選取HC（D/d）比值≥3菌株下一步篩選試驗(yàn)。

2.3 初篩菌株濾紙條降解效果

將初篩菌株濾紙條降解試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。可知，添加7號(hào)菌株濾紙潰爛成糊狀，濾紙條失重率為52.01%；添加1號(hào)菌株濾紙條接近糊狀，失重率為49.23%；添加2號(hào)和9號(hào)菌株濾紙條僅存在明顯彎曲現(xiàn)象，但未呈糊狀；3、4、5、8號(hào)菌株對(duì)濾紙條降解作用較小，濾紙未斷裂，僅邊緣出現(xiàn)毛邊；6號(hào)和10號(hào)對(duì)濾紙條基本不降解。因此，1

號(hào)和7號(hào)菌株對(duì)濾紙條降解能力較強(qiáng)。

表2 分離得到菌株菌落形態(tài)Table 2 Morphology of strains screened from enrichment cultivation

表3 纖維素降解菌透明圈直徑和菌落直徑Table 3 Diameters of transparent circles and colonies of strains

表4 纖維素降解菌對(duì)濾紙條降解結(jié)果Table 4 Filter paper degradation capacity of the celluloses degrading microbes

2.4 酶活力測(cè)定結(jié)果

將菌株置于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)2 d，設(shè)置3次重復(fù)，測(cè)定纖維素酶活和濾紙酶活，濾紙條降解效果、HC比值共同評(píng)價(jià)降解效果，復(fù)篩。最終得到2株CMC酶活和FPA酶活較高菌株（見(jiàn)圖1）。降解濾紙能力強(qiáng)菌株1號(hào)和7號(hào)CMC酶活和FPA酶活均較高，1號(hào)和7號(hào)菌株CMC酶活分別達(dá)26.82和31.28 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活分別達(dá)20.32和30.82 U·mL-1，高于其他菌株。因此，將1號(hào)和7號(hào)菌株作為復(fù)篩菌，發(fā)酵產(chǎn)酶條件分析。

圖1 纖維素降解菌株酶活性Fig.1 Enzyme activities of celluloses degrading microbes

2.5 纖維素降解菌產(chǎn)酶條件

2.5.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株酶活力影響

由圖2可知，0～48 h內(nèi)，兩種酶活均隨培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，在48～72 h內(nèi)，F(xiàn)PA酶活力輕微下降，但基本處于穩(wěn)定；而纖維素酶活迅速下降，說(shuō)明培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CMC酶活影響高于FPA酶活。因此，應(yīng)將48 h作為菌株最優(yōu)產(chǎn)酶時(shí)間。

2.5.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶影響

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，當(dāng)pH在4.0～10.0范圍時(shí)，CMC酶活和FPA酶活性隨pH增加迅速升高，至pH為6.0左右達(dá)到最大值；當(dāng)pH 6.0～7.0之間時(shí)，酶活性基本穩(wěn)定；pH超過(guò)7.5時(shí)，酶活性開(kāi)始逐漸降低，說(shuō)明中性條件下，1號(hào)和7號(hào)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力較高。因此，將pH為6.5作為最佳產(chǎn)酶pH。

2.6 纖維素降解菌分子生物學(xué)鑒定

2.6.1 16S rDNA鑒定

將測(cè)序在NCBI中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）16S rDNA序列一致性高達(dá)100%。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及掃描電鏡圖（見(jiàn)表5和圖4），可判定該菌是Bacillus subtilis。將所得全部序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其登錄號(hào)為MF592134。通過(guò)CLustal W軟件作序列比較和MEGA 5.0軟件分析得到以16S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖5）。結(jié)果表明1號(hào)菌株與Bacillus subtilis親緣關(guān)系較近。PCR產(chǎn)物片段經(jīng)電泳檢測(cè)（見(jiàn)圖8），圖中有明顯單一條帶，長(zhǎng)度約為1 400 bp，與Bacillus subtilis片段長(zhǎng)度一致。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活性影響Fig.2 Effect of culture time on enzyme activities

圖3 pH對(duì)酶活性影響Fig.3 Effect of pH on enzyme activity

表5 1號(hào)菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 5 Physiological and biochemical identification result of strain1

圖5 菌株1基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strains 1 based on 16S rDNA sequence homology

圖4 菌株1掃描電鏡圖Fig.4 SEM picture of strain 1

2.6.2 26S rDNA鑒定

將26S rDNA D1/D2區(qū)序列在NCBI中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與7號(hào)菌株相似性最高類群為隱球酵母菌（Cryptococcus flavescens），相似性達(dá)100%，該菌株在平板上菌株形態(tài)為圓形或者卵圓形，菌落為乳脂色、圓形、凸起、邊緣光滑，觀察掃描電鏡中菌落形態(tài)（見(jiàn)圖6）。

通過(guò)CLustal W軟件多序列比較和MEGA 5.0軟件分析得到以26S rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖7）。結(jié)果表明7號(hào)菌株與Cryptococcus flavescens親緣關(guān)系較近。將所得全部序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其登錄號(hào)為MF620126（26S rDNA D1/D2序列）。以NL1和NL4作為上下游引物，擴(kuò)增菌株26S rDNAD1/D2區(qū)域片段，片段長(zhǎng)度在506 bp，電泳結(jié)果見(jiàn)圖6，圖中7號(hào)菌株片段長(zhǎng)度與Cryptococcus flavescens一致。

圖6 菌株7掃描電鏡圖Fig.6 SEM picture of strain 7

圖7 菌株7基于26S rDNA序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of strains 7 based on 26S rDNA sequence homology

圖8 菌株Bacillus subtilis與Cryptococcus flavescens凝膠電泳Fig.8 Analysis of strain Bacillus subtilis and Cryptococcus flavescens fragment amplified by gel electrophoresis

3 討論

本試驗(yàn)篩選菌株1號(hào)屬于芽胞桿菌屬，與枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）生理生化特征相似，其CMC酶活可達(dá)26.82 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活可達(dá)20.32 U·mL-1。測(cè)定其生長(zhǎng)特性，發(fā)現(xiàn)菌株1號(hào)最適生長(zhǎng)pH為6.5，芽胞桿菌具有耐堿、耐酸、耐高溫等明顯優(yōu)勢(shì)，適應(yīng)環(huán)境能力很強(qiáng)，便于實(shí)際操作和工業(yè)生產(chǎn)[27-28]。李春鳳等研究表明，枯草芽孢桿菌生物同化作用較強(qiáng)，可有效降低糞便中吲哚、氨氣等有害氣體濃度，有利于糞便資源化利用[29]。

菌株7號(hào)屬于隱球酵母菌（Cryptococcus flavescens），其CMC酶活達(dá)31.28 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活達(dá)30.82 U·mL-1。隱球酵母是一種用于采后保鮮的生防酵母菌[30]，具有拮抗效果好、抑菌譜廣、營(yíng)養(yǎng)要求低、生長(zhǎng)快、不產(chǎn)生毒素、對(duì)多數(shù)化學(xué)殺菌劑不敏感等特點(diǎn)[31]，可與多種化學(xué)及物理方法結(jié)合使用，防治果實(shí)采后病害[32]。目前，國(guó)內(nèi)堆肥發(fā)酵研究尚無(wú)有關(guān)隱球酵母對(duì)堆肥效果影響報(bào)道，該菌株對(duì)纖維素降解效果研究相對(duì)較少。

纖維素酶活力決定菌株對(duì)纖維素物質(zhì)分解能力。劉清鋒等對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株青霉T24-2優(yōu)化后，獲得最大濾紙酶活力和內(nèi)切酶活力分別為6.89、45.01 U·mL-1[33]；李保深等研究對(duì)秸稈降解效果較好的斜臥青霉產(chǎn)酶條件，28℃、120 r·min-1培養(yǎng)4 d，濾紙酶活力和內(nèi)切酶活力分別達(dá)7.085、3.856 IU·mL-1[34]。本試驗(yàn)篩選出菌株1號(hào)和7號(hào)在30℃、pH 6.5培養(yǎng)48 h，F(xiàn)PA酶活和CMC酶活分別可達(dá)20.32、26.82 U·mL-1和30.82、31.28 U·mL-1，高于以上報(bào)道真菌和放線菌酶活力。說(shuō)明2株細(xì)菌屬于高產(chǎn)優(yōu)良纖維素分解菌，有利于堆體中纖維素物質(zhì)降解。本試驗(yàn)僅研究不同pH和培養(yǎng)時(shí)間條件下菌株產(chǎn)酶情況，由于酶產(chǎn)生和酶活力受諸多因素影響[35-36]，試驗(yàn)菌株產(chǎn)酶條件有待進(jìn)一步優(yōu)化。

4 結(jié)論

以剛果紅培養(yǎng)基和濾紙條降解試驗(yàn)作為初篩，從中選出透明圈與菌落直徑比值較大、濾紙條分解能力較強(qiáng)菌株，并對(duì)其液體發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定酶活力，得到CMC酶活和FPA酶活均較高2株菌——1號(hào)和7號(hào)。采用形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rDNA及26S rDNA鑒定方法，初步確定1號(hào)菌屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），7號(hào)菌屬于隱球酵母菌（Cryptococcus flavescens）。

研究枯草芽孢桿菌與隱球酵母在羧甲基纖維素鈉為唯一碳源產(chǎn)酶培養(yǎng)基中產(chǎn)酶特性，結(jié)果表明，1號(hào)和7號(hào)在剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后HC（D/d）比值為3.00、5.42，在pH 6.5，培養(yǎng)時(shí)間48 h條件下，1號(hào)和7號(hào)菌株CMC酶活達(dá)26.82和31.28 U·mL-1，F(xiàn)PA酶活達(dá)20.32和30.82 U·mL-1。

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