基于BSA法開發(fā)CAPS標(biāo)記定位甜瓜果面溝相關(guān)基因研究

王學(xué)征，邱 果，陳克農(nóng)，孫 慧，白 銀

（1.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

甜瓜（Cucumis melon.L）是葫蘆科黃瓜屬甜瓜亞屬一年生草本植物，種質(zhì)資源與變異類型豐富。目前，甜瓜果實(shí)性狀、葉片性狀、抗病性狀等重要農(nóng)藝學(xué)性狀已有相關(guān)性分析與基因定位。

甜瓜果皮相關(guān)性狀中，Obando等利用近等基因系與親本比較發(fā)現(xiàn)，控制果皮顏色QTL數(shù)量至少為13個(gè)[1]。楊光華等以黃綠皮、白肉、無(wú)覆紋自交系K1-7為母本，黃皮、橘紅肉、無(wú)覆紋自交系K3-92-1為父本雜交，構(gòu)建F2代群體，采用復(fù)用鳥槍基因分型法（Multiplexed shotgun genotyping，MSG）對(duì)F2群體作基因分型，將果皮底色基因定位在4號(hào)染色體，在相同區(qū)域定位到一個(gè)與果皮覆紋有關(guān)基因[2]。周慧文以厚皮甜瓜品系M4-5為母本，薄皮M1-15為父本，構(gòu)建F1和F2代群體，推測(cè)甜瓜外果皮類型性狀為質(zhì)量性狀[3]。外果皮厚度分離存在超親遺傳現(xiàn)象，該性狀為數(shù)量性狀，將兩個(gè)控制甜瓜果皮厚度QTL位點(diǎn)分別定位在第7和第11連鎖群。在甜瓜果肉相關(guān)性狀研究中，Monforte等通過F2代群體與雙單倍體群體作QTL分析，將控制甜瓜綠色果肉基因定位在第1號(hào)連鎖群，推測(cè)該基因與之前所記載gf基因吻合，控制橘紅色果肉基因被定位在第2號(hào)連鎖群和第12號(hào)連鎖群上，推測(cè)控制該性狀基因可能更復(fù)雜，需更大群體精細(xì)定位[4]。Cuevas等以甜瓜近等基因系群體為材料，初步定位到8個(gè)控制β-胡蘿卜素QTL位點(diǎn)，分布在4條連鎖群體上，解釋該性狀存在表型變異，發(fā)現(xiàn)控制甜瓜橘紅果肉和白色果肉位點(diǎn)位于第9連鎖群中部，該位點(diǎn)呼應(yīng)雙基因假說中wf基因[5]。Paris等在第2連鎖群上定位甜瓜果肉厚度QTL位點(diǎn)，在CU160（10 cM）與OPAL9_750（34 cM）之間[6]。欒非時(shí)等以厚皮甜瓜M4-5為母本，M1-15為父本，雜交獲得F1、F2代群體，定位到7個(gè)與果型指數(shù)相關(guān)QTL位點(diǎn)，分別位于第1連鎖群、第2連鎖群、第4連鎖群（2個(gè)）、第7連鎖群、第9連鎖群和第10連鎖群，采用不同試驗(yàn)群體研究性狀，同樣定位7個(gè)與果型指數(shù)相關(guān)QTL位點(diǎn)，并在第6連鎖群上獲得一個(gè)距離最小QTL位點(diǎn)[7-8]。甜瓜果實(shí)是否存在果面溝是甜瓜果皮類型呈現(xiàn)多樣性因素之一。果面溝影響甜瓜果皮結(jié)構(gòu)、物質(zhì)積累、果實(shí)受力及甜瓜果實(shí)裂果。保證成熟甜瓜果實(shí)完整無(wú)損、無(wú)裂果，有利于甜瓜運(yùn)輸與貯藏，也是甜瓜遺傳育種研究重點(diǎn)。因此，開展甜瓜果面溝性狀遺傳規(guī)律及相關(guān)基因定位研究，對(duì)甜瓜種質(zhì)資源改良和加快分子育種進(jìn)程具有重要意義。

現(xiàn)有測(cè)序方法難以準(zhǔn)確檢測(cè)生命體完整遺傳信息，在分子遺傳育種中遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用，CAPS標(biāo)記又稱酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列標(biāo)記，廣泛用于基因分型、定位、克隆和分子鑒定，該方法兼顧共顯性和位點(diǎn)特異性，且操作簡(jiǎn)便，成本低廉[9]。CAPS主要對(duì)PCR擴(kuò)增DNA片段限制性酶切分析，基于EST或已發(fā)表基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，將特異性PCR與限制性酶切結(jié)合檢測(cè)多態(tài)性[10]?；驹硎抢靡阎稽c(diǎn)DNA序列設(shè)計(jì)一系列特異性PCR產(chǎn)物（19～27 bp），擴(kuò)增該位點(diǎn)某一DNA片段，再用限制性內(nèi)切酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，利用凝膠電泳分離酶切片段，染色并RFLP分析。CAPS具有簡(jiǎn)潔解釋個(gè)體多態(tài)性、可區(qū)分純合基因型和雜合基因型、對(duì)所需DNA要求不高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[11]。

群體分離分析法（Bulked segregant analysis）即BSA法，是快速定位與目標(biāo)基因連鎖分子標(biāo)記有效方法。原理是在F2代群體挑選兩組性狀極端值，建DNA混池，計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)SNP-index，將兩個(gè)SNP-index作差計(jì)算ΔSNP-index，ΔSNP-index中顯著偏離0位點(diǎn)為候選位點(diǎn)。BSA定位目標(biāo)基因方法已廣泛應(yīng)用于作物育種，張?jiān)戚x等用BSA法在第11號(hào)染色體上定位到2個(gè)與水稻條紋葉枯病抗性有明顯關(guān)系的SSR分子標(biāo)記[12]。李曉娜利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合BSA法在第3條染色體上定位到一個(gè)控制玉米雄穗穗頸長(zhǎng)主效基因位點(diǎn)[13]。

本試驗(yàn)以無(wú)果面溝甜瓜品系M4-5為母本，有果面溝甜瓜品系M1-15為父本，通過雜交、回交以及自交獲得 P1、P2、F1、F2、BC1P1、BC1P2六世代群體，分析果面溝遺傳規(guī)律，并與裂果性狀作相關(guān)性分析。在F2代群體內(nèi)挑選有果面溝和無(wú)果面溝兩個(gè)極端性狀群體，BSA法確定控制該性狀基因所在區(qū)域，再將該區(qū)域SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為CAPS位點(diǎn)構(gòu)建遺傳圖譜并定位目標(biāo)基因，為進(jìn)一步開展甜瓜果面溝性狀基因克隆及種質(zhì)資源創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用厚皮甜瓜M4-5為母本材料，又稱伊麗莎白瓜，隸屬短毛甜瓜亞種，雄花兩性花同株，中早熟品系，果皮黃色，光滑，無(wú)果面溝，果肉厚。選用薄皮甜瓜品系M1-15作為父本材料，隸屬短毛甜瓜亞種，雄花兩性花同株，早熟品系，果皮綠色，有果面溝，果肉薄。以上試驗(yàn)材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院西甜瓜分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。利用雙親雜交配制六世代群體。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2016年5～9月，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地大棚播種父母本、F1群體、BC1P1群體、BC1P2群體及 F2代群體。P1、P2、F1、BC1P1、BC1P2采用完全隨即區(qū)組設(shè)計(jì)，各種植30株，每小區(qū)10株，3次重復(fù)，F(xiàn)2隨機(jī)種植300株（保苗285株，實(shí)際收獲282株）。2017年5～9月，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地大棚種植100株甜瓜自然群體。待果實(shí)成熟后收獲所有群體果實(shí)，統(tǒng)計(jì)果面溝性狀。田間管理采用埋土施肥、滴灌、雙蔓整枝。田間布局如圖1所示。

圖1 田間布局Fig.1 Distribution in plastic greenhouse

1.3 果實(shí)性狀調(diào)查方法

沿果實(shí)中軸橫切，觀察果肉外圍是否凹陷，判斷是否存在果面溝。觀察是否裂果。

1.4 分子標(biāo)記試驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.4.1 分子試驗(yàn)材料

選用M4-5和M1-15雜交、自交、回交產(chǎn)生六世代群體及甜瓜自然群體，采集幼嫩葉片，提取DNA備用。

1.4.2 DNA提取

采用改良CTAB法[14]提取雙親材料M4-5和M1-15、 F1、 BC1P1、 BC1P2、 F2群 體 和 甜 瓜 自 然 群 體DNA。提取過程中應(yīng)用氯仿異戊醇溶液（24∶1）抽提3次，避免移液過程中槍頭吸取蛋白質(zhì)。

1.4.3 BSA法定位基因位點(diǎn)

在F2代群體中，各選出有果面溝和無(wú)果面溝20個(gè)果實(shí)組成兩個(gè)池，將對(duì)應(yīng)植株DNA稀釋到華大基因所需濃度，自行混合成DNA池，華大基因作BSA定位。

1.4.4 CAPS分子標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)BSA結(jié)果圖上顯示基因位置，確定目標(biāo)染色體。在該染色體上，參照已公布甜瓜基因組數(shù)據(jù)，利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院西甜瓜分子育種實(shí)驗(yàn)室自編Perl腳本選取SNP位點(diǎn)前后大約500 bp堿基序列，通過SNP2CAPS軟件獲得酶切位點(diǎn)處有差異候選序列，將SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為CAPS標(biāo)記。將目標(biāo)染色體平均分成15等份，在每等份相同或相似位置上挑選CAPS位點(diǎn)，引物命名方式為：M+染色體序號(hào)+引物序號(hào)。CAPS分子標(biāo)記加密時(shí)同樣使用此方法，初定位兩個(gè)標(biāo)記間設(shè)計(jì)引物。

1.4.5 CAPS標(biāo)記篩選與驗(yàn)證

采用降落式PCR反應(yīng)對(duì)引物作PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為1 μL模板DNA 、0.1 μL Taq酶,、正反向引物各 0.5 μL、0.5 μL dNTP Mix、1 μL 10×PCR Buffer（緩沖液）和6.75 μL雙蒸水。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性7 min、94℃變性1 min、60℃復(fù)性30 s、每個(gè)循環(huán)降低0.5℃、72℃延伸90 s、30個(gè)循環(huán)、72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，利用4種限制性核酸內(nèi)切酶 Eco R I、Hind III、Bam H I、Pst I，分別對(duì)相應(yīng)PCR產(chǎn)物酶切驗(yàn)證，體系為：5 μL PCR產(chǎn)物、0.3 μL限制性內(nèi)切酶（濃度為10 U·mL-1）、1.5 mol·L-1Tango buffer（酶對(duì)應(yīng)緩沖液）、8.2 μL 雙蒸水，酶切反應(yīng)置于37℃恒溫水浴鍋或37℃恒溫箱中，確保酶切反應(yīng)高效運(yùn)行。酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

利用QTL IciMapping對(duì)具有多態(tài)性且應(yīng)用于F2代群體基因分型的分子標(biāo)記繪制遺傳連鎖圖譜，依據(jù)CAPS標(biāo)記在染色體上編號(hào)及與連鎖群對(duì)應(yīng)關(guān)系，將連鎖群命名為Chromosome+染色體序號(hào)。

1.6 目的基因定位方法

Microsoft?Excel 2007統(tǒng)計(jì)果面溝性狀田間調(diào)查數(shù)據(jù)，SPSS 19.0軟件作相關(guān)性分析，QTL IciMapping軟件將其與分子數(shù)據(jù)相合對(duì)F2群體定位，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，以1.0 cM為步移單位在全基因組范圍內(nèi)掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜果面溝性狀遺傳分析

母本M4-5田間表型均無(wú)果面溝，父本M1-15田間表型均有果面溝，F(xiàn)1代田間表型表現(xiàn)為均有果面溝，F(xiàn)2代群體產(chǎn)生性狀分離，共種植300株F2代群體，由于環(huán)境原因，共收獲282株甜瓜，其中有果面溝∶無(wú)果面溝比例為213∶69，基本符合3∶1遺傳規(guī)律，BC1P1共收獲30株果實(shí)，其中有果面溝∶無(wú)果面溝為18∶12，BC1P2共收獲30株果實(shí)，所有果實(shí)表現(xiàn)均為有果面溝?？梢酝茢?，甜瓜果實(shí)果面溝性狀為顯性遺傳，受一對(duì)基因調(diào)控。

2.2 甜瓜果面溝性狀與裂果相關(guān)性分析

甜瓜母本M4-5為易裂果，父本M1-15為不易裂果甚至不裂果，在F1代表型中，大多果實(shí)不裂果，極小部分果實(shí)呈輕微裂果狀，在F2群體中，不裂果與裂果數(shù)量比為206∶76，比值為2.7，趨于3∶1。因裂果受外界因素影響嚴(yán)重，無(wú)法判定該性狀遺傳規(guī)律。通過觀測(cè)F2代果實(shí)，發(fā)現(xiàn)其他變量相同或相似時(shí)，有果面溝甜瓜多為不裂果，無(wú)果面溝甜瓜多為裂果。利用SPSS 19.0軟件對(duì)果面溝與裂果性狀作相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示，果面溝與裂果呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表1 果面溝與裂果相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of surface groove and dehiscent fruit

2.3 甜瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

2.3.1 甜瓜試驗(yàn)材料DNA提取

利用改良CTAB法提取甜瓜基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖2。經(jīng)檢測(cè)，雙親材料、F1、F2、BC1P1、BC1P2、自然群體（Natural population）DNA濃度和純度均可用于分子標(biāo)記檢測(cè)，基本不含有RNA和蛋白質(zhì)，極少量雜質(zhì)對(duì)分子標(biāo)記檢測(cè)無(wú)影響。

2.3.2 BSA法定位結(jié)果

將有果面溝和無(wú)果面溝兩個(gè)性狀DNA混池送華大基因測(cè)序，獲得一張BSA初定位結(jié)果圖（見圖3）。結(jié)果顯示，第6號(hào)和第11號(hào)染色體具有明顯波動(dòng)峰值。推斷控制果面溝基因位點(diǎn)可能存在于第6號(hào)或第11號(hào)染色體上。相比于第6號(hào)染色體，第11號(hào)染色體定位范圍更小，峰值波動(dòng)更大，目標(biāo)基因在第11號(hào)染色體上存在可能性更大。

2.3.3 CAPS引物篩選與驗(yàn)證

根據(jù)雙親基因組重測(cè)序結(jié)果，第6號(hào)和第11號(hào)染色體各設(shè)計(jì)30對(duì)CAPS引物（將染色體基因組長(zhǎng)度均分為15段，在每段切割位點(diǎn)或其近似地方各設(shè)計(jì)2對(duì)引物），用雙親及F1單株DNA對(duì)其作PCR反應(yīng)和酶切驗(yàn)證。其中第6號(hào)染色體具有多態(tài)性引物24對(duì)（每段分割點(diǎn)及其相似位置處均保證有一個(gè)多態(tài)性引物），多態(tài)率為80%，第11號(hào)染色體具有多態(tài)性引物28對(duì)，多態(tài)率達(dá)93.3%，在上述結(jié)果中等區(qū)段分割處選出存在多態(tài)性引物15對(duì)。篩選多態(tài)性引物部分結(jié)果如圖4所示。

圖2 甜瓜試驗(yàn)材料DNAFig.2 DNA of test material in melon

圖3 甜瓜果面溝BSA分析結(jié)果Fig.3 BSA result of the surface groove in melon

圖4 CAPS引物在P1、P2、F1代多態(tài)性表現(xiàn)Fig.4 Polymorphism of CAPS primers among P1,P2and F1generation

2.3.4 甜瓜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

以M4-5和M1-15為遺傳研究背景，以含有282株單株F2代群體為繪圖群體，以QTL IciMapping軟件分別在第6號(hào)和第11號(hào)染色體上用15對(duì)具有多態(tài)性CAPS標(biāo)記繪制一張?zhí)鸸线z傳連鎖圖譜。圖譜結(jié)果顯示，第6號(hào)染色體上未定位到與果面溝性狀相關(guān)位點(diǎn)，因此排除控制果面溝基因位點(diǎn)在第6號(hào)染色體上可能性。利用CAPS標(biāo)記分析第11號(hào)染色體，如圖5所示，圖譜長(zhǎng)度為181.87 cM，共包含15對(duì)CAPS標(biāo)記，定位到2個(gè)控制果面溝性狀位點(diǎn)，其中一個(gè)qYG-1-1位點(diǎn)位于標(biāo)記M11-5和M11-3之間，但是該位點(diǎn)所在位置與CAPS標(biāo)記所在區(qū)域順序不符，且分析數(shù)據(jù)表明該位點(diǎn)貢獻(xiàn)率幾乎為0，說明該位點(diǎn)存在錯(cuò)誤。另一個(gè)位點(diǎn)為qYG-1-2，位于兩標(biāo)記M11-51和M11-53之間，兩標(biāo)記之間距離為3.42 cM。

為獲得更近基因位點(diǎn)，在M11-51和M11-53標(biāo)記之間平均設(shè)計(jì)10對(duì)引物，其中具有多態(tài)性為3對(duì)。用5對(duì)引物對(duì)該群體進(jìn)一步構(gòu)建CAPS標(biāo)記遺傳圖譜，遺傳圖譜結(jié)果如圖6所示。圖譜覆蓋長(zhǎng)度為5 cM，定位到一個(gè)與果面溝性狀有關(guān)位點(diǎn)，qGroove-1-1，位于CAPS標(biāo)記M11-01與M11-51之間，兩標(biāo)記之間距離為1.1 cM，加性效應(yīng)值為-0.2407，表明該基因位點(diǎn)對(duì)果面溝起反向加性效應(yīng)。

圖5 果面溝性狀在11號(hào)染色體上的位點(diǎn)Fig.5 Locus of fruit surface groove on chromosome 11 in melon

圖6 甜瓜果面溝性狀在11號(hào)染色體上加密后位點(diǎn)Fig.6 Exact locus of fruit surface groove on chromosome 11 in melon

2.4 CAPS標(biāo)記在自然群體中有效性檢驗(yàn)

利用甜瓜自然群體對(duì)CAPS標(biāo)記M11-01和M11-51作有效性檢驗(yàn)，通過這兩個(gè)標(biāo)記對(duì)100株甜瓜自然群體PCR擴(kuò)增和酶切分析顯示，分子數(shù)據(jù)與田間性狀符合率為74.67%和75.99%，結(jié)果表明果面溝性狀可穩(wěn)定遺傳，上述2個(gè)CAPS標(biāo)記可用于甜瓜果面溝分子標(biāo)記輔助選擇育種。

3 討論與結(jié)論

3.1 利用BSA法定位基因優(yōu)劣

BSA法最早用于抗病基因定位[15]，隨研究不斷深入，BSA法逐漸應(yīng)用于質(zhì)量性狀單基因或數(shù)量性狀主效基因定位，僅由一對(duì)具有相對(duì)性狀親本雜交，其產(chǎn)生分離群體理論上適用于BSA法[16]。優(yōu)點(diǎn)是可快速找到與目的基因緊密連鎖分子標(biāo)記，初步定位目標(biāo)基因所在染色體，無(wú)需繪制全部基因組長(zhǎng)度遺傳連鎖圖譜，減少工作量，縮短工作時(shí)間。近年來(lái)，BSA方法已應(yīng)用于黃瓜[17]、番茄[18]、甜瓜[19]等園藝植物，且成功定位部分目標(biāo)基因。但該技術(shù)也有不足之處，無(wú)法精細(xì)定位基因區(qū)間，目標(biāo)基因初步定位后還需進(jìn)一步結(jié)合遺傳圖譜、分子標(biāo)記或擴(kuò)大群體等精細(xì)定位[20]。甜瓜果面溝性狀由一對(duì)基因控制質(zhì)量性狀，因此可利用BSA法定位。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)BSA法無(wú)法將目標(biāo)基因準(zhǔn)確定位在具體某一位點(diǎn)[20]。本試驗(yàn)將控制甜瓜果面溝性狀基因初定位在第11號(hào)染色體后半段，根據(jù)親本重測(cè)序數(shù)據(jù)，在該區(qū)域開發(fā)CAPS標(biāo)記，通過加密第11號(hào)染色體遺傳圖譜，最終將控制甜瓜果面溝性狀基因定位在距離為1.1 cM兩個(gè)CAPS標(biāo)記之間。本研究中，BSA法同時(shí)將目標(biāo)基因定位在兩條染色體上，出現(xiàn)該結(jié)果可能是兩個(gè)基因池間存在其他性狀差異導(dǎo)致，因此，應(yīng)用BSA法建立極端性狀池時(shí)應(yīng)考慮不同性狀差異。

3.2 甜瓜果面溝性狀調(diào)查方法

因?yàn)楣鏈显贔2果實(shí)中表型存在深淺差異，應(yīng)沿果實(shí)中心軸橫切，觀察橫截面判定果實(shí)是否具有果面溝。馬雙武認(rèn)為果實(shí)表面存在條形覆紋處即是果面溝[21]，但通過對(duì)F2群體調(diào)查過程發(fā)現(xiàn)，存在果實(shí)表面有條形覆紋但果皮光滑，無(wú)果面溝，說明果皮覆紋與果面溝之間并無(wú)必然聯(lián)系。同一植株果實(shí)，果面溝也存在深淺不一情況，推斷果面溝可能受其他因素（果實(shí)成熟度和坐果位置等）影響。

3.3 果面溝與裂果相關(guān)性分析

甜瓜果面溝性狀與裂果呈顯著負(fù)相關(guān)，說明存在果面溝甜瓜果實(shí)不易裂果，對(duì)于甜瓜采后貯藏與運(yùn)輸具有重要作用。但甜瓜是否裂果受環(huán)境影響較大，該性狀可能由果面溝與其他環(huán)境因素共同導(dǎo)致，需在擴(kuò)大群體并盡量保證其他因素一致前提下，深入研究確定兩個(gè)性狀間更準(zhǔn)確相關(guān)性。

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