試論丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法化學(xué)發(fā)光檢測的應(yīng)用

陳贏 於瑞敏

摘 要：目的：研究丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法化學(xué)發(fā)光檢測的應(yīng)用。方法：采集250份血液篩選結(jié)果為陰性標(biāo)本以及250例質(zhì)控血液樣本，分別對其應(yīng)用雙抗原夾心法進(jìn)行丙型肝炎病毒抗體檢測，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果：本組208例HCV抗體陽性樣本中，一共檢出206例，敏感性為99.04%。結(jié)論：采取雙抗原夾心法對HCV抗體進(jìn)行檢測的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，敏感性較高，臨床優(yōu)勢顯著，值得關(guān)注并推廣。

關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒抗體；雙抗原夾心法；化學(xué)發(fā)光檢測；應(yīng)用

引言

在血液篩查中，丙型肝炎病毒（HCV）是一項重要的血液篩查項目，目前主要應(yīng)用到的檢測方法包括化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法、時間分辨熒光免疫分析法，這些檢測方法都是間接檢測的方法。但是這些檢測方法具有假陽性率高的缺陷，進(jìn)而增加了臨床檢驗成本，也給患者造成了不必要的精神負(fù)擔(dān)。因此，設(shè)計一種具有高靈敏性的Anti-HCV檢測方法就顯得極其重要。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本材料來源

標(biāo)本材料來源于2016年1月-2017年1月間南京市人民醫(yī)院血液篩選陰性樣本，隨機(jī)抽取其中的250份作為研究對象，并收集250份質(zhì)控血液樣本。

1.1.2試劑材料來源

雙抗原夾心法HCV抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）：北京萬泰生物（國藥準(zhǔn)字：S20130002，批號：2015061008），以下簡稱萬泰雙抗原夾心法。

上海浩源生物科技有限公司的丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（I型）核酸檢測試劑盒（PCR-熒光法）（國藥準(zhǔn)字S20110011）。

1.2方法

選擇本次選取的一共500份血液標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格的檢測，并應(yīng)用雙抗原夾心法對HCV抗體進(jìn)行檢測。

1.2.1抗原制備

第一，生物標(biāo)記抗原的制備。取一定量重組融合的HCV抗原，并應(yīng)用pH9.5、0.05mol/L的CB將其濃度調(diào)整為1mg/mL；根據(jù)抗體：生物素=1：10-20mol的比例添加適量已活化的生物素，在溫室中反應(yīng)0.5-1.0h；將反應(yīng)液移入透析袋內(nèi)，并應(yīng)用pH9.5、0.05mol/L的CB透析24h，最后加入等量的甘油，將其放置在零下20℃內(nèi)進(jìn)行保存。第二，吖啶酯標(biāo)記抗原的制備取一定量重組融合HCV抗原，采用pH9.5、0.05mol/LCB調(diào)整濃度為1mg/mL；按抗原：吖啶酯=1：10-20mol比加入已活化吖啶酯，室溫反應(yīng)0.5-1.0h；將反應(yīng)液移至透析袋，采用pH9.5、0.05mol/LCB透析24h，加入等量甘油，放置在零下20℃內(nèi)進(jìn)行保存。

1.2.2操作方法

首先，將樣本與吖啶酯標(biāo)記重組抗原與生物素標(biāo)記重組丙型肝炎抗原進(jìn)行反應(yīng)，然后讓其生成抗原-抗體-抗原的夾心式復(fù)合體，將鏈霉親和素磁微粒加入其中，讓復(fù)合體與之相互作用，形成固相。其次，將反應(yīng)液放置在磁場內(nèi)，在反應(yīng)液中的磁微粒吸附完全后，對其進(jìn)行洗滌，除去未結(jié)合物。最后，注入化學(xué)發(fā)光激發(fā)液，檢測其化學(xué)發(fā)光光子的強(qiáng)度，并根據(jù)臨界值對其是否含有Anti-HCV樣品進(jìn)行判定。

2結(jié)果

應(yīng)用雙抗原夾心法對標(biāo)本進(jìn)行檢測，在250份標(biāo)本中，206例為陽性標(biāo)本，2例為陰性樣本，應(yīng)用ChironRIBA確認(rèn)試劑對其進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)均成陽性，雙抗原夾心法檢測的敏感性為99.04%。具體情況詳見表1。

3討論

丙型肝炎呈全球性流行，全球HCV的感染率約為3%，我國一般人群Anti-HCV陽性率為3.2%，丙型肝炎慢性化率為50%-85%，慢性丙型肝炎的肝硬化率為10%-15%，失代償期肝硬化的10年生存率僅為25%，慢性丙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化患者中，每年肝癌發(fā)生率為1%-7%。HCV常呈隱匿性感染，容易被忽視。一旦感染HCV，病程越長，越難治愈；慢性丙型肝炎可逐漸進(jìn)展成肝硬化、肝細(xì)胞癌等嚴(yán)重肝臟疾患，從而造成沉重的身心負(fù)擔(dān)，故應(yīng)重視丙型肝炎的篩查。丙型肝炎已有有效的治療藥物，如能及早治療，可防止其發(fā)展為肝硬化和肝癌。對丙型肝炎早期篩查、早期診斷、早期治療十分重要。因此，研制一種高靈敏度、高特異的試劑盒對丙型肝炎的防治有著重要的意義。

對患者HCV抗體進(jìn)行檢測是確定其是否發(fā)生感染的初步階段，主要有用作篩檢工作的酶免疫檢測（EIA）以及用作確證工作的重組免疫印跡試驗（RIBA），其中RIBA由于需要較高費(fèi)用且并未建立嚴(yán)格試驗標(biāo)準(zhǔn)，目前在臨床診療中并無較多應(yīng)用。由于EIA存在較為明顯的便利性及穩(wěn)定性、自動化功能強(qiáng)、價格較低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床中應(yīng)用到血液篩查及檢測工作中較為廣泛。目前EIA發(fā)展至第三代，依然實施間接法予以檢測，因其方法學(xué)存在一定固有缺陷性，極易導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性及漏檢情況。目前在臨床中將雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測試劑作為發(fā)展方向具有較為明顯的應(yīng)用價值，夾心法可使得酶標(biāo)記的特異性抗原將間接法檢測時酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行取代，由此完成整個檢測，與間接酶聯(lián)免疫吸附實驗法進(jìn)行比較，其對于樣品檢測存在雙特異性選擇特點(diǎn)，可以將血清內(nèi)出現(xiàn)的抗HCV的總抗體完成檢測，有效防止間接酶聯(lián)免疫吸附實驗法所存在的檢測弊端，確保檢測結(jié)果具有更高的敏感性與特異性，而且因為HCV抗原所具有的分子量較小，以酶進(jìn)行HCV抗原的直接性標(biāo)記，往往使得空間位阻情況發(fā)生，導(dǎo)致抗體與抗原無法輕易結(jié)合，存在較為明顯抑制作用，因此HCV抗原的標(biāo)記是建立抗HCV抗體的雙抗原夾心ELISA檢測方法的一個較為重要的難點(diǎn)。

結(jié)束語

應(yīng)用雙抗原夾心法化學(xué)發(fā)光檢測實驗，可以有效提高HCV感染診斷試劑的特異性以及其檢出率，并有效縮短檢出時間，在臨床上值得推廣使用。

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