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    mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒載體和真核表達(dá)載體的構(gòu)建及體外的穩(wěn)定表達(dá)

    2018-06-08 09:35:16王晶哲王小鈴王娟楊鑫鑫閆美娜李欣悅王薈劉霞邵啟祥
    關(guān)鍵詞:糖基化質(zhì)粒載體

    王晶哲, 王小鈴, 王娟, 楊鑫鑫, 閆美娜, 李欣悅, 王薈, 劉霞, 邵啟祥

    (江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

    T細(xì)胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif,ITIM)結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell Ig and ITIM domin,TIGIT)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的具有免疫抑制作用的共刺激分子,是NK和T細(xì)胞共有的抑制性受體[1];其是由244個(gè)氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白,含有一個(gè)IgV樣結(jié)構(gòu)域的胞外段、一個(gè)跨膜區(qū)及一個(gè)含ITIM的胞內(nèi)段[2]。TIGIT能夠與CD226競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(poliovirus receptor,PVR,即CD155)從而抑制T細(xì)胞的活化,TIGIT與PVR結(jié)合的親和力遠(yuǎn)高于CD226。PVR主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞表面[3-4]。TIGIT與樹突狀細(xì)胞表面的PVR結(jié)合后促進(jìn)IL-10表達(dá),抑制IL-12(p40)表達(dá)[5]。研究表明,TIGIT與自身免疫性腦脊髓炎(EAE)等多種自身免疫性疾病有關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PDL-1/2抗體治療會(huì)出現(xiàn)耐藥,而耐藥的主要原因是腫瘤微環(huán)境表達(dá)大量的TIGIT等負(fù)向調(diào)節(jié)分子[7-8],因此深入闡明TIGIT等分子的生物學(xué)功能,研發(fā)其阻斷型抗體進(jìn)行臨床腫瘤治療就顯得尤為迫切。

    mLumin是華中科技大學(xué)武漢國(guó)家光電實(shí)驗(yàn)室(籌)駱清銘和張智紅教授通過(guò)基因重組構(gòu)建的一種新型的紅色熒光蛋白,發(fā)射波長(zhǎng)為621 nm[9]。mLumin的組織穿透能力強(qiáng),并且光譜串?dāng)_比較小[10],所以是一種良好的熒光蛋白??乖砦粚?duì)抗體的制備具有重要意義,本研究擬建立一個(gè)能夠用于蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜表面表達(dá)的通用載體,為此我們選擇TIGIT作為靶分子,構(gòu)建其胞外序列、跨膜區(qū)和mLumin表達(dá)載體,為后期篩選陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)分選目標(biāo)細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠,6~8周,雄性,本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):No.201708296。

    1.1.2 主要試劑和儀器 人腎上皮HEK-293T細(xì)胞為我院許文榮教授惠贈(zèng);非洲綠猴腎成纖維Cos7細(xì)胞由我院錢海老師惠贈(zèng),細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃,5% CO2和含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中。plenti-puro慢病毒質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室杜鳳移老師贈(zèng)送;pcDNA3.1-mLumin紅色熒光蛋白質(zhì)粒由華中科技大學(xué)武漢光電國(guó)家實(shí)驗(yàn)室張智紅教授惠贈(zèng)。PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(HindⅢ,BamHⅠ,XbaⅠ,XhoⅠ)、T4DNA連接酶、DL2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物和Trizol為TaKaRa公司產(chǎn)品;PCR引物、DNA膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司;LipfectamineTM2000 (Invitrogen公司);S1000TMThermal Cycler PCR儀(Bio-Rad公司);恒溫培養(yǎng)搖床QYC-211(上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司);TCS SP5Ⅱ共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 plenti-puro-mTIGIT-mLumin和pcDNA-mTIGIT-mLumin載體的構(gòu)建與鑒定

    1.2.1.1 mTIGIT胞外段、跨膜區(qū)和mLumin基因序列特異性引物設(shè)計(jì) 檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.uniprot.org/),獲得小鼠mTIGIT胞外段及跨膜區(qū)的cDNA序列。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)查找mLumin序列。按照序列設(shè)計(jì)引物后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行比對(duì),根據(jù)載體上可用的限制性內(nèi)切酶加于引物兩端并選擇特定的保護(hù)性堿基。

    因?yàn)閜lenti-puro和pcDNA3.1的載體不同,根據(jù)載體酶切位點(diǎn)的不同設(shè)計(jì)2對(duì)mTIGIT特異性引物和mLumin特異性引物。合成的引物序列見表1(表中下劃線表示酶切位點(diǎn))。

    1.2.1.2 小鼠脾臟細(xì)胞RNA的提取 采用CO2麻醉處死C57BL/6小鼠,無(wú)菌眼科鑷剪取脾;用無(wú)菌 PBS沖洗后剪碎,并輕輕吹打,200目篩網(wǎng)過(guò)濾;PBS洗2次,棄上清液;加入紅細(xì)胞裂解液作用8 min;4 ℃,1 500 r/min離心5 min,PBS洗滌2次,棄上清液;加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞,按照說(shuō)明書提取總RNA。

    1.2.1.3 mTIGIT和mLumin序列的擴(kuò)增、純化和回收 取脾細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用PCR技術(shù)獲得目的序列并回收。mLumin序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行膠回收。

    表1 mTIGIT基因和mLumin基因的PCR引物

    1.2.1.4 目的基因與載體進(jìn)行酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選 將獲得的mLumin序列與對(duì)應(yīng)的載體用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切;經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)擴(kuò)增;搖床37 ℃振蕩12~16 h,提取質(zhì)粒;再以提取的質(zhì)粒為載體與mTIGIT序列進(jìn)行雙酶切;再次連接之后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)擴(kuò)增,提取質(zhì)粒;將提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序鑒定,利用PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析對(duì)比。

    1.2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及熒光鑒定

    1.2.2.1 熒光顯微鏡檢測(cè)plenti-puro-mTIGIT-mLumin重組質(zhì)粒 將重組質(zhì)粒與pspax、pMD2.0G(3 ∶2 ∶1)用無(wú)血清DMEM共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞8~12 h,然后換成10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基,分別收取24 h和48 h的病毒上清液;再將病毒與含血清培養(yǎng)基按1 ∶1的比例加入新的HEK-293T細(xì)胞,感染24~48 h,用熒光顯微鏡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)。

    1.2.2.2 共聚焦顯微鏡檢測(cè)pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞(方法同“1.2.2.1”),48 h之后加入G418至1 mg/mL,篩選獲取陽(yáng)性克隆,并在共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的表達(dá)。

    2 結(jié)果

    2.1 mTIGIT和mLumin基因的克隆

    針對(duì)plenti-puro載體設(shè)計(jì)mTIGIT和mLumin的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為689 bp和751 bp,酶切位點(diǎn)分別為HindⅢ、BamHⅠ和XbaⅠ。針對(duì)pcDNA3.1載體的產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為689 bp和746 bp,酶切位點(diǎn)分別為BamHⅠ,XhoⅠ和XbaⅠ。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示,出現(xiàn)的目的條帶位置與預(yù)期一致。表明PCR擴(kuò)增的基因克隆正確,見圖1。

    M:DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物;N:空白對(duì)照;T:mTIGIT擴(kuò)增產(chǎn)物;L:mLumin擴(kuò)增產(chǎn)物;A:mTIGIT(plenti-puro載體);B:mLumin(plenti-puro載體);C:mTIGIT(pcDNA3.1載體);D:mLumin(pcDNA3.1載體)

    2.2 plenti-puro-mTIGIT-mLumin和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

    2.2.1 plenti-puro-mTIGIT質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定以及測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析,plenti-puro-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

    2.2.2 pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析,證實(shí)pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖3。

    2.3 兩種載體均能很好地表達(dá)于目的細(xì)胞胞膜

    目的基因mTIGIT-mLumin融合蛋白定位于細(xì)胞膜表面,而只攜帶mLumin基因的質(zhì)粒其蛋白則表達(dá)于整個(gè)細(xì)胞(為了可以與陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比,圖片拍于未用puromycin篩選前)。見圖4。

    利用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察,確認(rèn)mTIGIT-mLumin融合蛋白成功表達(dá)于Cos7細(xì)胞表面。見圖5。

    M:DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物;P:載體酶切產(chǎn)物;T-L:mTIGIT-mLumin融合基因;A:plenti-puro載體的雙酶切產(chǎn)物電泳圖;B:mTIGIT-mLumin融合基因陽(yáng)性質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果;C:mTIGIT-mLumin融合基因陽(yáng)性質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果;D:測(cè)序結(jié)果

    M:DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物;P:載體酶切產(chǎn)物;T-L:mTIGIT-mLumin融合基因;A:pcDNA3.1載體的雙酶切電泳圖;B:mTIGIT-mLumin融合基因陽(yáng)性質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

    圖4 對(duì)照質(zhì)粒及plenti-puro-mTIGIT-mLumin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果(200×)

    3 討論

    近來(lái)CAR-T和PD-1/PDL-1抗體的免疫生物治療取得了突破性進(jìn)展,淋巴瘤治療總體有效率達(dá)到50%~60%[1-2]。但在治療中出現(xiàn)了耐PD-1/PDL-1抗體的現(xiàn)象,通過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)這些患者的腫瘤微環(huán)境表達(dá)大量的TIGIT、LAG3和TIM3等[8]。TIGIT主要表達(dá)于NK和T細(xì)胞,其抑制NK細(xì)胞毒作用,引起T細(xì)胞的耗竭和增強(qiáng)Treg的功能[11-12]。研究證明抑制TIGIT有利于促進(jìn)抗腫瘤免疫治療[11,13]。共同阻斷PD-1和TIGIT時(shí),能明顯恢復(fù)其抗腫瘤的CD8+T細(xì)胞的活性[14]。

    圖5 重組質(zhì)粒融合蛋白的表達(dá)

    以往抗體的制備除了采用天然抗原外,還采用基因工程蛋白作為抗原的主要來(lái)源,而抗體的產(chǎn)生與抗原的功能性表位密切相關(guān)。目前基因工程表達(dá)的蛋白多來(lái)源于原核的工程菌,缺乏糖基化,而糖基化對(duì)抗原決定簇的性質(zhì)影響很大,故導(dǎo)致許多表位的缺失。即使采用畢赤酵母等進(jìn)行表達(dá),其添加的寡糖只有甘露糖殘基,而動(dòng)物和人等高等真核生物的寡糖組成有N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖和唾液酸等。此外,在對(duì)糖基化蛋白選擇上,畢赤酵母與高等真核生物也有很多不同,有些蛋白在天然宿主中并不會(huì)被糖基化,但畢赤酵母卻能使這些蛋白糖基化。而有些蛋白在天然宿主中被糖基化,但在畢赤酵母中其絲氨酸和蘇氨酸未糖基化,因此其表達(dá)的抗原特異性也與原宿主蛋白有很大的差異。再者即使是原宿主來(lái)源蛋白,如果經(jīng)過(guò)變性處理,特別是甲醛等處理,容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)間基團(tuán)的交聯(lián),隨著空間結(jié)構(gòu)的改變其抗原特異性也部分發(fā)生改變。本研究建立了以mLumin熒光蛋白為指示系統(tǒng)的跨細(xì)胞膜蛋白表達(dá)載體,既可以表達(dá)蛋白,又可指示蛋白質(zhì)是否能表達(dá)于細(xì)胞膜表面,還有利于采用流式細(xì)胞術(shù)分選。此外,該表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)TIGIT跨膜區(qū)及胞外段蛋白,mLumin熒光蛋白起到了很好的指示效果。

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