皮下埋植纈沙坦緩釋制劑對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及血藥濃度的影響

羅玉梅， 姜德謙， 白楊， 李春萍， 鐘艷霞， 郭洪波， 羅玉嬋， 羅玉君

(1. 深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科， 廣東 深圳 518172； 2. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院心內(nèi)科， 湖南 長沙 410011； 3. 廣東醫(yī)科大學(xué)研究生院， 廣東 湛江 524023)

中國國家心血管病中心發(fā)布的《中國心血管病報告2017》[1]顯示，我國18歲以上居民高血壓患病率達(dá)25.2%，估算全國高血壓患者為2.7億。而高血壓是心腦血管疾病的主要危險因素，超過半數(shù)的心腦血管病發(fā)病與高血壓有關(guān)。心腦血管病居死因首位，占總死亡原因的43.8%，因此控制血壓達(dá)標(biāo)是降低心腦血管疾病及死亡率的重要手段。但目前國內(nèi)高血壓治療率低至41.1%，達(dá)標(biāo)率僅13.8%。治療率及達(dá)標(biāo)率低的原因主要有以下兩類：一是高血壓患者需要長期每天口服一種或數(shù)種藥物來控制血壓，給工作、生活帶來不便；其二，由于口服藥物需經(jīng)胃腸道吸收、肝臟的首過效應(yīng)等過程，其最終起作用的分量僅為口服劑量的百分之幾至幾十，因此口服藥物的劑量是其體內(nèi)有效成分的數(shù)倍甚至數(shù)百倍，加上口服制劑的賦形劑等成分的作用，更容易產(chǎn)生消化道刺激等多種毒副反應(yīng)，導(dǎo)致患者主動或被動停藥。為此，本研究擬探索一種埋植一次能穩(wěn)定降壓長達(dá)數(shù)周甚至更長時間，同時可減少藥物毒副反應(yīng)的治療高血壓的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

15只14周齡SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，體重(295±13)g，5只14周齡SPF級雄性Wistar大鼠，體重(507±24)g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2012- 0001。上述大鼠均飼養(yǎng)于湖南省斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司SPM級動物房；溫度20～26 ℃；相對濕度40%～70%；換氣次數(shù)10～20 次/h；照明時間：每日12 h/12 h，黑暗/光照交替；照明度15～20 Lx；自由飲水及標(biāo)準(zhǔn)實驗室飲食；實驗動物使用許可證號：SYXK(湘)2014-0012。

纈沙坦皮下埋植管的制作：截取硅膠管10 cm，稱取纈沙坦(上海瑞永生物科技公司)100 mg藥粉，用粗針頭導(dǎo)入上述硅膠管，導(dǎo)入完畢后用醫(yī)用膠水將硅膠管兩端封閉5 mm，用75%乙醇浸泡30 min，再用生理鹽水浸泡1 h，用紗布包裹晾干過夜備用(避光)。灌胃用的纈沙坦溶液的配制：稱取10 mg纈沙坦藥粉加蒸餾水10 mL配成濃度1 mg/mL纈沙坦溶液，即用即配。

主要實驗儀器：大小鼠無創(chuàng)血壓儀(型號Bp-98A，北京軟隆生物科技有限公司)；Legend MACH1.6R型臺式高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(型號Triple Quad/LC-30AD)和Triple Quad 5500質(zhì)譜儀(美國AB儀器公司)；色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅢ(150 mm×2.0 mm)；保護(hù)柱：phenomenex C18(4.0 mm×3.0 mm，5 μm)。

1.2 大鼠分組及埋植手術(shù)

將SHR隨機分為空白對照組、纈沙坦埋植組、纈沙坦灌胃組，每組5只；空白組、埋植組大鼠分別于皮下植入空白硅膠管、纈沙坦緩釋制劑(100 mg/s)，灌胃組于每天早上9:00～10:00用纈沙坦溶液灌胃(16 mg/kg)。另以5只Wistar大鼠作為正常對照組行假手術(shù)。各組大鼠均干預(yù)15 d。

手術(shù)方法：將大鼠以8%水合氯醛溶液(0.5 mL/100 g體重)麻醉后，在頸背部消毒后橫向切1 cm小口，用止血鉗探入真皮下鈍性分離皮下組織，分別皮下植入空白硅膠管或纈沙坦緩釋硅膠管；正常對照組大鼠僅切開皮膚，不植入硅膠管即縫合。

1.3 尾動脈血壓測量

各組大鼠于干預(yù)前測量尾動脈血壓1次，空白組、埋植組和正常對照組大鼠術(shù)后3 d開始測量血壓，灌胃組在給藥后第2天開始測血壓，每天8:00～14:00間測量1次，連續(xù)測量3 d，之后隔日測量，周期15 d。測量前充分烤尾，采用無創(chuàng)動物智能血壓計(BP-98A，日本軟隆生物技術(shù)有限公司)，按照說明書要求測量大鼠清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓及舒張壓，3 min內(nèi)測得3組數(shù)據(jù)，收縮壓差值不超過5 mmHg方為有效數(shù)據(jù)，取3組有效數(shù)據(jù)的平均值。

1.4 大鼠血藥濃度測定

埋植組大鼠于皮下埋植纈沙坦緩釋藥前及埋藥后1、2、4、8、12、24、48(第2天)、72(第3天)、144(第6天)、192(第8天)、360(第15天) h分別從眼眶內(nèi)眥靜脈叢采血，灌胃組大鼠于初次給藥后的1、2、4、8、12 h及第2、3、6、8、15天給藥前分別從眼眶內(nèi)眥靜脈叢采血，抗凝，取血漿，采用超高相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法檢測各采血時間點大鼠血漿樣品中纈沙坦的血藥濃度。檢測方式：正離子多重反應(yīng)監(jiān)測模式；TEM：550 ℃；GAS1：55 Psi (1 psi≈6.9 kPa)；GAS2：55 Psi；Curtain GAS：35 Psi；CAD：8 Psi；IS：5 500 V。分析物及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜條件見表1。

表1 分析物及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜條件

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)前各組大鼠尾動脈血壓比較

干預(yù)前空白組、埋植組、灌胃組SHR尾動脈血壓之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但上述3組尾動脈收縮壓及舒張壓均明顯高于正常對照組Wistar大鼠(P均<0.01)。見表2。

2.2 干預(yù)后各組大鼠尾動脈血壓比較

干預(yù)3 d后，埋植組和灌胃組SHR尾動脈收縮壓較前下降，但與空白組SHR相比并未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，仍顯著高于正常對照組(P均<0.01)。干預(yù)7 d后，埋植組及灌胃組SHR收縮壓均明顯低于空白組(P均<0.01)，與正常對照組收縮壓間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；這種趨勢一直持續(xù)至干預(yù)后第15天。

分組干預(yù)前干預(yù)后收縮壓舒張壓收縮壓3 d7 d15 d空白組159±8a201±7a188±9192±10198±8埋植組155±10a202±6a169±6148±8b145±5b灌胃組171±7a217±11a181±10161±7b155±10b正常對照組119±6152±10c,e144±9b,d,e146±9b137±6bF值6.848.913.905.2110.73P值<0.01<0.01<0.05=0.01<0.01

a:P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.01，與空白組比較；c：P<0.01，d：P<0.05，與埋植組比較；e：P<0.01，與灌胃組比較

2.3 纈沙坦緩釋劑對大鼠血藥濃度的影響

埋植組及灌胃組SHR在給藥前血清中纈沙坦藥物濃度均為零。埋植組SHR在皮下埋植了纈沙坦緩釋劑2 h后，血漿纈沙坦?jié)舛冗_(dá)到2.21 μg/mL，此后一直維持在2.43～3.39 μg/mL之間。灌胃組在纈沙坦初次灌胃后1 h，血藥濃度升至6.28 μg/mL，明顯高于埋植組SHR(P<0.01)，2 h達(dá)峰值13.6 μg/mL，此后開始下降，于第12小時降至2.41 μg/mL，與埋植組SHR間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，至第24小時(次日服藥前)降至1.16 μg/mL，顯著低于埋植組(P<0.05)，此后灌胃組大鼠每日同樣藥量灌胃1次，于第72小時開始，埋植、灌胃兩組SHR測定的血藥濃度間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，直至第15天(360 h)干預(yù)結(jié)束。兩組藥動學(xué)參數(shù)見圖1 。

a：P<0.01，與埋植組比較

3 討論

皮下埋植緩釋藥物用于治療需長期用藥的疾病由來已久。自20世紀(jì)70年代采用具有緩釋作用的硅橡膠與低劑量的具有避孕作用的孕激素組合埋植皮下研究長效甾體避孕藥以來，以高分子化合物為載體的皮下埋植緩釋避孕劑在臨床上得到廣泛應(yīng)用。其機制就是藥物以恒定、緩慢、穩(wěn)定的速度和濃度釋放，直接通過皮下組織吸收進(jìn)入血液循環(huán)，避免了傳統(tǒng)經(jīng)胃腸吸收的口服藥物需經(jīng)肝臟代謝產(chǎn)生的首過效應(yīng)，通過對藥物劑量的有效控制，降低藥物初期在體內(nèi)產(chǎn)生的藥物濃度高峰而帶來的相應(yīng)毒副反應(yīng)，并且減少了服藥次數(shù)，最終提高了藥效的穩(wěn)定性和利用率[2]。參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-8]，本研究采用緩釋硅膠管作為載體，制作成纈沙坦皮下埋植緩釋降壓制劑；為減少埋植管植入大鼠出現(xiàn)排異反應(yīng)及局部纖維組織增生，本研究參考王霞萍等[9]的方法，用醫(yī)用膠水封閉膠管，減少埋植局部的炎癥反應(yīng)。因纈沙坦為長效降壓藥，每日僅需服用1次。為了解口服藥物及皮下埋植緩釋制劑一天內(nèi)的藥物代謝參數(shù)變化，本研究在干預(yù)24 h內(nèi)選擇了經(jīng)典的血藥濃度監(jiān)測時間點取血測定血藥濃度；為了解兩種給藥途徑對SHR長時程血藥濃度的影響，選擇了第2天、第3天、第6天、第8天、第15天灌胃組SHR服藥前時間點取血，比較每日最低的血藥濃度與皮下埋植緩釋制劑的差別。

本實驗結(jié)果顯示，纈沙坦緩釋劑埋植組及纈沙坦溶液灌胃組SHR血壓在給藥后均逐漸降低；于用藥后第7天，兩組SHR收縮壓降至正常水平，且兩組血壓間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此可知，皮下埋植緩釋藥物只需用藥1次，即可達(dá)到與每天口服藥物一樣的降壓的效果，與呂鵬威等[10]的研究結(jié)果一致。由于不需每天用藥，可減少長期服藥給患者帶來的麻煩及消化道不良反應(yīng)，皮下埋植緩釋制劑治療高血壓的方式可能達(dá)到改善患者依從性，從而提高高血壓治療率及達(dá)標(biāo)率的效果。

皮下埋植緩釋纈沙坦制劑2 h后，SHR血漿中的纈沙坦藥物濃度達(dá)到穩(wěn)定水平，一直持續(xù)到2周后。這一現(xiàn)象表明，承載有纈沙坦原藥的硅膠緩釋劑可以一定的速率將藥物穩(wěn)定地釋放入機體內(nèi)環(huán)境，并在用藥后2 h即達(dá)到穩(wěn)定的血藥濃度。結(jié)合SHR血壓變化趨勢，說明纈沙坦血漿濃度達(dá)到2.43～3.39 μg/mL，即可使SHR的收縮壓降至目標(biāo)范圍。每日1次口服藥物，SHR血藥濃度波動明顯較皮下埋植緩釋劑大，血藥濃度峰值可達(dá)到皮下埋植緩釋劑的4.8倍，而最低水平又低于皮下埋植緩釋劑組。血藥濃度大幅度波動給患者帶來更多更明顯的藥物毒副反應(yīng)，且影響血壓的平穩(wěn)度。而毒副反應(yīng)是導(dǎo)致患者停藥的重要原因，最終影響高血壓患者的治療率及達(dá)標(biāo)率。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，與口服藥物相比，皮下埋植纈沙坦緩釋制劑，僅用藥1次，即可達(dá)到與每天口服藥物一樣穩(wěn)定的目標(biāo)血壓，療效可長達(dá)2周；并維持更為穩(wěn)定的血藥濃度。因此，應(yīng)用皮下埋植的緩釋降壓制劑可能減少口服藥物所帶來的麻煩以及毒副反應(yīng)，從而提高高血壓病的治療率及達(dá)標(biāo)率。

與傳統(tǒng)理念不同的是，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，盡管用藥后，無論是皮下埋植緩釋制劑還是每天口服藥物，血藥濃度在數(shù)小時內(nèi)即可達(dá)到產(chǎn)生療效的水平，但SHR的血壓卻在1周后才達(dá)到平穩(wěn)的目標(biāo)血壓。這說明藥物在血液中達(dá)在一定濃度后，要分布到降壓的組織并產(chǎn)生穩(wěn)定的效應(yīng)，需要約1周時間。因本研究僅觀察了纈沙坦一種藥物，其他藥物的緩釋劑是否也存在同樣的作用及特點，還需要更多的研究證實。但從理論上來說，因分子量、溶解特性等參數(shù)不同，達(dá)到穩(wěn)定的血藥濃度時間及起效時間應(yīng)該也會各自不同。本課題組正與材料學(xué)專家合作，研制新型的高分子材料載體，制作更為先進(jìn)的可皮下埋植的超長效緩釋制劑，并擴大藥物的研究范圍，期待能研制出一系列超長效的新型抗高血壓制劑，改變目前需每天服藥的高血壓治療模式。

綜上，皮下埋植纈沙坦緩釋制劑用藥1次，可達(dá)到長效平穩(wěn)降壓的效果；且維持的血藥濃度比口服用藥更為穩(wěn)定。

[ 1 ] 陳偉偉, 高潤霖,劉力生,等.中國心血管病報告2017概要[J].中國循環(huán)雜志,2018, 33(1): 1-8.

[ 2 ] Gu SJ，Du MK，Zhang LD, et al. A 5-year evaluation of NORPLANT contraceptive implants in China[J]. Obstet Gynecol,1994,83(5 Pt 1):673-678.

[ 3 ] Ingberg E,Theodorsson A,Theodorsson E,et al.Methods for long-term 17β-estradiol administration to mice[J]. Gen Comp Endocrinol, 2012,175(1): 188-193.

[ 4 ] Isaksson IM, Theodorsson A, Theodorsson E, et al. Methods for 17β-estradiol administration to rats[J]. Scand J Clin Lab Invest,2011,71(7):583-592.

[ 5 ] Strom JO,Theodorsson E,Theodorsson A.Order of magnitude differences between methods for maintaining physiological 17β-estradiol concentrations in ovariectomized rats[J]. Scand J Clin Lab Invest，2008,68(8):814-822.

[ 6 ] Dubal DB,Wise PM.Neuroprotective effects of estradiol in middle-aged female rats[J]. Endocrinology, 2001,142(1):43-48.

[ 7 ] Strom JO,Theodorsson E, Holm L,et al. Different methods for administering 17β-estradiol to ovariectomized rats result in opposite effects on ischemic brain damage[J]. BMC Neurosci，2010,11:39.

[ 8 ] Meachem SJ，Schlatt S，Ruwanpura SM，et al. The effect of testosterone，dihydrotestosterone and oestradiol on the re-initiation of spermatogenesis in the adult photoinhibited Djungarian hamster[J]. J Endocrinol，2007,192(3):553-561.

[ 9 ] 王霞萍,韓曉.硅橡膠緩釋管的篩選及體內(nèi)埋植效果驗證[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2015,12(4):219-214.

[10] 呂鵬威，呂匯川.長效降血壓埋植棒的前瞻性臨床研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2008,46(32):370-372.