菌株F21來(lái)源α-淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)研究1

郭宏文1，2，徐婷婷1，2，劉曉蘭1，2，姜未公1，馬瑞1

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

在酶制劑工業(yè)中，α-淀粉酶是最早實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)且用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑品種，幾乎占淀粉酶制劑總產(chǎn)量的50%以上[1]。通常，中性α-淀粉酶的最適pH范圍為6.0～8.0，而酸性α-淀粉酶最適pH范圍為4.0～6.0。與中性α-淀粉酶相比，酸性α-淀粉酶能夠在酸性條件下水解淀粉，保持高活性。憑借它的優(yōu)勢(shì)，酸性α-淀粉酶在食品加工、釀造發(fā)酵、制糖、紡織、造紙、醫(yī)藥和飼料等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛[2-4]。目前工業(yè)應(yīng)用的α-淀粉酶主要來(lái)源于細(xì)菌和絲狀真菌[5-6]，生產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株則主要為黑曲霉和枯草芽孢桿菌[7-8]。研究和開發(fā)新型的酸性α-淀粉酶具有極高的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者在開發(fā)新型的酸性α-淀粉酶方面開展了一些研究，如屈建航等[9]篩選到產(chǎn)α-淀粉酶的酵母菌菌株SH3，所產(chǎn)α-淀粉酶的最適pH值為5.0，最適溫度為50℃。權(quán)淑靜等[10]對(duì)黑曲霉菌株A-5-3所產(chǎn)α-淀粉酶進(jìn)行了酶性質(zhì)研究，酶的最適pH值為3.6，最適溫度為70℃，具有很好的酸穩(wěn)定性且為非Ca2+依賴型水解酶。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室從白酒廠的酒醅中分離篩選的產(chǎn)α-淀粉酶菌株F21進(jìn)行誘變選育[11]，并對(duì)其所產(chǎn)的α-淀粉酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，為開發(fā)新型的酸性α-淀粉酶在酶的純化方面提供一些基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）F21：本實(shí)驗(yàn)室從酒醅中分離并經(jīng)誘變選育得到。

1.1.2 培養(yǎng)基[12]

菌種保藏培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.2 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂粉2.0 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.2 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO·47H2O 0.05 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉2.0 g，豆餅粉1.5 g，K2HPO40.1 g，MgSO·47H2O 0.05 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

快速辛基-瓊脂糖凝膠（OctylSepharoseFastFlow）填料：美國(guó)Amersham Biosciences公司；硫酸銨（色譜純）：生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器公司；HYG-III回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備公司；CR21GⅢ日立高速冷凍離心機(jī)：天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司；AKTAPrime蛋白純化系統(tǒng)：美國(guó)GE公司；Octyl-Sepharose Fast Flow層析柱（1.6 cm×20 cm）：上海錦華層析設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

菌株的活化：將菌種接種到斜面培養(yǎng)基，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

種子液制備：活化后的菌種接入裝有25 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于36℃、180 r/min條件下的搖床中培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵液制備：取2.4mL種子液接種到裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在40℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h。

粗酶液制備：發(fā)酵液經(jīng)四層紗布過濾后，在8 000 r/min條件下離心20 min，取上清液備用。

1.3.2 蛋白含量的測(cè)定

參見Folin-酚試劑法（Lowry法）[13]測(cè)定蛋白含量。

1.3.3α-淀粉酶活測(cè)定

參見YOO J Y等[14-15]的方法測(cè)定α-淀粉酶活。

α-淀粉酶活定義：在pH 4.6、溫度60℃條件下，5 min水解1mg可溶性淀粉（0.5%）所需的酶量為一個(gè)活力單位（U）。

相對(duì)酶活：酶活與相同反應(yīng)條件下酶活最大值的比值（%）。

酶比活力：酶活與蛋白濃度的比值，用每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)表示（U/mg）。

1.3.4 硫酸銨鹽析

將5 mL上清液裝入離心管中，在4℃條件下，分別緩慢加入飽和度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的硫酸銨，4℃靜置過夜，經(jīng)10 000 r/min冷凍離心20 min后，收集各管中的沉淀，測(cè)定不同硫酸銨飽和度條件下對(duì)應(yīng)的蛋白濃度和α-淀粉酶活，繪制鹽析曲線[16]。

1.3.5 Octyl-Sepharose Fast Flow柱層析

色譜方法及條件：平衡液為飽和度40%的硫酸銨溶液；洗脫液使用0.02 mol/L pH7.0磷酸緩沖液（phosphatic buffer solution，PBS）；流速為2mL/min；上樣量為15mL。樣品上樣后先用120 mL飽和度為40%的硫酸銨沖洗，然后用120 mL飽和度為40%的硫酸銨和等體積的0.02 mol/L pH7.0 PBS進(jìn)行梯度洗脫（洗脫液中硫酸銨飽和度40%～0%），最后用0.02 mol/LpH 7.0 PBS洗脫，用自動(dòng)部分收集器定時(shí)收集3 mL/管，檢測(cè)各管收集液的蛋白吸光度值及α-淀粉酶活，收集酶活高的洗脫液[16]。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

最適反應(yīng)pH：采用pH為3.5～10.5的不同緩沖液配制反應(yīng)體系，于55℃條件反應(yīng)，并計(jì)算相對(duì)酶活力。

最適反應(yīng)溫度：酶反應(yīng)體系于35～90℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，并計(jì)算相對(duì)酶活力。

pH穩(wěn)定性：酶液分別在不同pH（3.5～10.5）條件下處理1 h后進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定相對(duì)酶活。

溫度穩(wěn)定性：酶液分別在不同溫度（35～90℃）條件下處理1 h后進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定相對(duì)酶活。

不同金屬離子對(duì)酶活的影響：酶反應(yīng)體系中添加0.5 mmol/L不同種類的金屬離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））后，于最適pH和溫度條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定相對(duì)酶活。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值，圖利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到。

2 結(jié)果

2.1 硫酸銨鹽析

采用不同飽和度的硫酸銨對(duì)粗酶液進(jìn)行鹽析，測(cè)定硫酸銨沉淀中的蛋白濃度及酶活，制作鹽析曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1 硫酸銨鹽析曲線Fig.1 The curve of ammonium sulfate fractionation

由圖1可知，硫酸銨飽和度低于40%時(shí)，目的酶蛋白沉淀的量很少，飽和度在40%～60%時(shí)，目的酶蛋白隨硫酸銨量的增加開始大量析出，酶活同時(shí)迅速增大。當(dāng)飽和度超過60%時(shí)，目的酶蛋白的析出量增加很少，酶活增加很小，而雜蛋白仍大量析出。硫酸銨飽和度為50%、60%和70%時(shí)酶活分別為804.7 U/mL、1 053.2 U/mL和1 115.5 U/mL。計(jì)算了各飽和度目的酶蛋白的比活力，50%飽和度的比活力為1 826.7，60%飽和度的比活力為1 617.6，70%飽和度的比活力1 173.0。綜合考慮比活力及酶活，為了達(dá)到較好純化效果而又減少酶活的損失。因此，選擇使用60%飽和度的硫酸銨對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鹽析以沉淀回收目的酶蛋白。

2.2 Octyl-Sepharose Fast Flow柱層析

測(cè)定不同收集液的OD280nm值和酶活，制作疏水層析曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 Octyl-Sepharose F F疏水層析曲線Fig.2 The elution curve of Octyl-Sepharose Fast Flow Hydrophobic chromatography

由圖2可知，共出現(xiàn)三個(gè)蛋白峰，第一個(gè)峰在沖冼的階段，是沒有被疏水分離介質(zhì)吸附上的蛋白質(zhì)，峰值最大，OD280nm值為1.565，蛋白量最多。第二個(gè)峰在梯度洗脫過程中出現(xiàn)，是吸附在分離介質(zhì)上的被一定濃度的PBS洗脫下來(lái)的部分蛋白，其峰值小，OD280nm值為0.432，蛋白含量少。第三個(gè)峰出現(xiàn)在用無(wú)硫酸銨的PBS沖洗的階段，峰值最小，是吸附在分離介質(zhì)上的結(jié)合力最強(qiáng)的少量蛋白。分別測(cè)定這三個(gè)蛋白峰對(duì)應(yīng)的各管酶活，僅第一個(gè)峰有酶活，活性峰與蛋白峰幾乎重合。說(shuō)明酶沒能被分離介質(zhì)所吸附，在第一階段被緩沖液洗下。而第二、第三個(gè)峰的蛋白均無(wú)酶活，屬于雜蛋白峰。通過本次疏水層析達(dá)到了一定的純化效果，去除了酶液中被疏水分離介質(zhì)吸附的雜蛋白。

2.3 α-淀粉酶純化結(jié)果

粗酶液、60%飽和度的硫酸銨對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鹽析沉淀后用蒸餾水溶解及Octyl-Sepharose Fast Flow柱層析洗脫液中各指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 a-淀粉酶的純化結(jié)果Table 1 Purification results of α-amylase

2.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 酶反應(yīng)最適pH及pH穩(wěn)定性

不同pH對(duì)酶活的影響及pH穩(wěn)定性結(jié)果見圖3。由圖3可知，酶在pH4.8時(shí)反應(yīng)的活力最大，酶反應(yīng)的最適pH值為4.8，在酸性條件pH 4.5～6.0范圍內(nèi)酶反應(yīng)活力較高，相對(duì)酶活在75%以上。在中性條件pH 7.0條件下，相對(duì)酶活為66.2%，在堿性條件酶反應(yīng)仍保持較高的活力，pH 9.0時(shí)的相對(duì)酶活為60.9%，pH10時(shí)的相對(duì)酶活為53.9%。結(jié)果表明，酶在pH 4.0～9.0的范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，相對(duì)酶活保持在90%以上，且在酸性環(huán)境pH 4.5條件下最為穩(wěn)定。酶在pH 4.0條件下的相對(duì)酶活為91.8%，pH5.0條件下的相對(duì)酶活為98.2%，可見，該酶具有較好的耐酸性。

圖3 反應(yīng)pH對(duì)酶活性的影響及酶的pH穩(wěn)定性Fig.3 Effect of reaction pH on enzyme activity and pH stability of enzyme

2.4.2 酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性

不同反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響及酶的熱穩(wěn)定性結(jié)果見圖4。由圖4可知，酶反應(yīng)溫度為55℃時(shí)的活力最大，酶反應(yīng)的最適溫度為55℃。酶在50～65℃范圍內(nèi)反應(yīng)具有較高活力，相對(duì)酶活在90%以上。當(dāng)溫度大于75℃時(shí)酶活急劇下降，75℃酶反應(yīng)時(shí)的相對(duì)酶活為76.9%，90℃酶反應(yīng)時(shí)的相對(duì)酶活只有44.1%。酶的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果為，酶在35℃條件下最穩(wěn)定，在溫度低于45℃的條件下比較穩(wěn)定，活力保持在35℃時(shí)酶活的90%以上，在高于60℃的條件下酶迅速失活，60℃條件下的殘余酶活為65.5%，75℃條件下的殘余酶活只有8.9%。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)酶活性的影響及酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Effect reaction temperature of enzyme activity and temperature stability

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活的影響

以不添加金屬離子時(shí)的酶活為對(duì)照，金屬離子對(duì)酶活的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+對(duì)酶活有激活作用，其中Ca2+對(duì)酶的活性激活作用較強(qiáng)，活力比對(duì)照提高了17.8%。其余金屬離子對(duì)酶的活性有一定的抑制作用，其中Fe2+和Fe3+的抑制作用較強(qiáng)，活力只為對(duì)照的88.2%和89.2%。

圖5 不同金屬離子對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of different metal ions on enzyme activity

3 結(jié)論

本研究采用硫酸銨鹽析和疏水作用層析對(duì)菌株F21所產(chǎn)的α-淀粉酶粗酶液進(jìn)行純化并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。研究發(fā)現(xiàn)，該α-淀粉酶反應(yīng)的最適溫度為55℃，最適pH值為4.8，屬于一種中溫酸性α-淀粉酶。酶在pH 4.0～9.0及低于45℃的環(huán)境下比較穩(wěn)定。Ca2+對(duì)酶的活性有較強(qiáng)的激活作用，F(xiàn)e2+及Fe3+對(duì)酶的活性有較強(qiáng)的抑制作用。該α-淀粉酶對(duì)鈣離子有依賴性，這與文獻(xiàn)報(bào)道的多種酸性α-淀粉酶的特點(diǎn)是一致的。該α-淀粉酶穩(wěn)定存在的pH范圍廣范，具有較好耐酸性的同時(shí)，在中性及偏堿性條件下也比較穩(wěn)定，且在中性及偏堿性條件下的酶活仍保持在酸性條件下酶活的60%以上，使該酶具有一定的研究開發(fā)價(jià)值。

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