乙酰輔酶A含量對(duì)釀酒酵母乙酸乙酯合成的影響

鄭 楠，郭慶煥，何亞輝，錢 泓，趙 東，陳葉福*，郭學(xué)武，肖冬光

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

白酒是世界六大著名蒸餾酒之一，歷史可追溯至數(shù)千年。白酒中的微量風(fēng)味物質(zhì)是影響白酒品質(zhì)的主要因素，約占1%～2%，其中酯類物質(zhì)又占微量成分的60%～90%，因此提高白酒的酯含量對(duì)于形成白酒風(fēng)味典型性具有非常重要的意義[1-2]。乙酸乙酯是清香型白酒的主體香味成分，適量的乙酸乙酯能夠使得酒體豐滿、柔和、香味協(xié)調(diào)，其含量的高低直接決定清香型白酒品質(zhì)的好壞。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）是白酒釀造過程中重要的發(fā)酵微生物，但產(chǎn)乙酸乙酯較少，清香型白酒中生成乙酸乙酯的主要微生物是產(chǎn)酯酵母，但產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酒精能力弱，增加糧耗，且大多數(shù)為好氧微生物，液態(tài)發(fā)酵會(huì)阻止產(chǎn)酯作用的進(jìn)行，因此通過改造釀酒酵母提高乙酸乙酯產(chǎn)量具有重要意義。研究表明[3]，酵母合成乙酸酯類有兩種途徑，一種是在酵母自身所含有的少量酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯；另一種是乙醇和酰基輔酶A在醇?；D(zhuǎn)移酶的作用下在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)生物催化生成相應(yīng)的酯類，這是釀酒酵母中乙酸酯類的主要合成途徑。對(duì)于液體發(fā)酵，乙酸乙酯的形成依賴于底物乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）、乙醇的濃度和醇乙?；D(zhuǎn)移酶的活性。

乙酰輔酶A是工業(yè)生產(chǎn)上合成膽固醇、酮體和脂質(zhì)等許多重要產(chǎn)品的前體物。在釀酒酵母中，不同的細(xì)胞區(qū)隔，如線粒體、胞液和過氧化物酶體中均能產(chǎn)生乙酰輔酶A。在胞液中，丙酮酸經(jīng)過丙酮酸脫羧酶、乙醛脫氫酶、乙酰輔酶A合成酶的催化作用形成乙酰輔酶A。乙酰輔酶A合成酶（acetyl coenzyme A synthetase，ACS）基因由ACS1和ACS2兩個(gè)基因編碼[4]。乙酰輔酶A水解酶（acetyl coenzyme Ahydrolase，ACH）由ACH1基因編碼，催化乙酰輔酶A水解為乙酸和輔酶A，可參與細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A調(diào)節(jié)[5]。

目前國內(nèi)外學(xué)者提高乙酸乙酯的含量主要是通過篩選高產(chǎn)乙酸乙酯菌株[6]或者利用基因工程手段過表達(dá)醇酰基轉(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferase，ATF）基因ATF1、ATF2和Lg-ATF1[7-11]。DONG J等[12]通過調(diào)節(jié)ATF1基因的啟動(dòng)子強(qiáng)度使白酒中乙酸乙酯的含量提高了3.1倍。ZHANG C Y等[13]在工業(yè)啤酒酵母中通過轉(zhuǎn)化多拷貝質(zhì)粒過表達(dá)ATF1基因，使乙酸乙酯的產(chǎn)量增加為原來的9倍。提高醇酰基轉(zhuǎn)移酶能夠在一定程度上提高乙酸乙酯的生成量，但其限制因素還包括底物乙酰輔酶A和乙醇的濃度，釀酒酵母進(jìn)行酒精發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生充足的乙醇，所以乙酰輔酶A的含量是最根本的限制因素。綜上，通過提高底物乙酰輔酶A的含量來提高乙酸乙酯生成量是一個(gè)可行的思路。同時(shí)，也為其他以乙酰輔酶A為底物的產(chǎn)品生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。因此，本研究通過敲除ACH1基因降低乙酰輔酶A的分解，過表達(dá)ACS1和ACS2基因增強(qiáng)乙酰輔酶A合成酶的活性，過表達(dá)ATF1基因提高底物乙酰輔酶A含量，進(jìn)而提高乙酸乙酯的生成量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY15的單倍體菌株α5：天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏；游離表達(dá)質(zhì)粒Yep352、過表達(dá)ATF1基因的質(zhì)粒PABBK和帶有釀酒酵母磷酸甘油激酶基因（PGK1）強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒Yep-PGK1、pGAPza質(zhì)粒：本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pUG6：德國Hegemann教授惠贈(zèng)。ACS1/ACS2基因來自于釀酒酵母α5。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。

LB培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L。

以上兩種培養(yǎng)基，自然pH值，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂，121℃滅菌15 min。

半乳糖誘導(dǎo)液態(tài)培養(yǎng)基：半乳糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，121℃滅菌15min。

一級(jí)種子培養(yǎng)基：糖度為8°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

二級(jí)種子培養(yǎng)基：糖度為12°Bx的玉米水解液，酵母浸粉5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：60 g玉米粉按1∶3（g∶mL）的料液比加水，70℃糊化20 min，加30 μL淀粉酶85～90℃液化90 min，加適量營養(yǎng)鹽和酸性蛋白酶及90 μL糖化酶55～60℃糖化20 min后制得。

1.1.3 試劑和酶

淀粉酶（29萬U/mL）、糖化酶（10萬U/mL）：諾維信生物技術(shù)有限公司；酸性蛋白酶（10萬U/mL）：尤特爾生化有限公司；蘋果酸脫氫酶（1200U/mg）、檸檬酸合酶（1000U/mg）、限制性內(nèi)切酶（10 U/μL）、rTaq聚合酶（5 U/μL）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶（350 U/μL）、博來霉素（Zeocin）、遺傳霉素（G418）、Rever TraAceRqPCR RT Kit：寶生物工程（大連）有限公司；卡那霉素抗性基因（KanMX）：德國Merck公司；酵母基因組DNA提取試劑盒、酵母核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；引物：金唯智生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCT-200型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴(kuò)增儀、DYY-4c型電泳儀：美國BIO-RAD公司；Reference-2型移液槍：法國吉爾森公司；7890型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、1260型號(hào)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司；StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 突變菌株的構(gòu)建

（1）引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中ACH1、ACS1、ACS2和ATF1基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物見表1。所有引物均由金唯智生物科技有限公司合成，酶切位點(diǎn)以下劃線表示。

表1 試驗(yàn)所用PCR引物Table 1 PCR primers used in the study

續(xù)表

（2）重組質(zhì)粒Yep-PAK1、Yep-PAK2和Yep-ATF1的構(gòu)建

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）公布的S.cerevisiaeS288c的ACS1和ACS2基因序列，以釀酒酵母α5的基因組為模板，用引物ACS1-U/ACS1-D、ACS2-U/ACS2-D分別PCR擴(kuò)增ACS1和ACS2基因片段，使用XhoI對(duì)質(zhì)粒Yep-PGK1、ACS1及ACS2基因片段進(jìn)行酶切、連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep-PA1和Yep-PA2。用引物K-U/K-D擴(kuò)增質(zhì)粒pUG6中的KanMX基因片段，再使用SphI對(duì)KanMX基因片段和質(zhì)粒Yep-PA1、Yep-PA2進(jìn)行酶切、連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep-PAK1和Yep-PAK2，構(gòu)建流程如圖1（a）所示。

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的質(zhì)粒PABBK為模板，PGK1-U和KAN-D為引物，PCR擴(kuò)增得到4 877 bp的PGK1P-ATF1-PGK1T-KanMX基因條帶，用SmaI酶切Yep352質(zhì)粒和PGK1PATF1-PGK1T-KanMX基因連接，得到重組質(zhì)粒Yep-ATF1，構(gòu)建流程如圖1（b）所示。

圖1 重組質(zhì)粒Yep-PAK和Yep-ATF1的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombined plasmids Yep-PAK and Yep-ATF1

（3）ACH1基因缺失突變株α5ΔACH1的構(gòu)建

利用長引物法構(gòu)建ACH1基因缺失突變株，在ACH1的5′和3′端分別取64 bp和63 bp的同源序列AA和AB，添加到擴(kuò)增篩選標(biāo)記KanMX片段的上下游引物K-U和K-D的5′端，構(gòu)成長引物AK-U和BK-D，從pUG6質(zhì)粒中擴(kuò)增具有同源序列的AA-KanMX-AB片段。經(jīng)醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到酵母單倍體菌株α5中，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有1000μg/mL G418的YEPD平板上進(jìn)行篩選，PCR驗(yàn)證。

（4）過表達(dá)ACS基因突變株α5-A的構(gòu)建

為分別實(shí)現(xiàn)ACS1及ACS2基因的整合過表達(dá)，以基因ACH1作為替代位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)ACS1及ACS2基因過表達(dá)的同時(shí)ACH1基因的敲除。分別以重組質(zhì)粒Yep-PAK1和Yep-PAK2為模板，利用長引物AP-U和BK-D，分別PCR擴(kuò)增得到重組片段AA-PGK1P-ACS1-PGK1T-KanMX-AB及AA-PGK1P-ACS2-PGK1T-KanMX-AB。經(jīng)醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到酵母單倍體菌株α5中，使AA和AB兩個(gè)片段與酵母基因組上ACH1基因兩側(cè)的同源序列發(fā)生同源重組，如圖2所示。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含有1 000 μg/mL G418的YEPD平板上進(jìn)行篩選，挑取轉(zhuǎn)化子并提取酵母基因組，以引物A-U和A′-D，B-U和B-D進(jìn)行定點(diǎn)上下游定點(diǎn)驗(yàn)證。得到過表達(dá)ACS基因突變株α5-A1和α5-A2。

圖2 重組片段的同源重組過程Fig.2 Process of homologous recombination of recombination fragment

（5）過表達(dá)ATF1基因突變株的構(gòu)建

為了在α5△ACH1、α5-A1和α5-A2這3個(gè)菌株中過表達(dá)ATF1基因，需要再次利用KanMX抗性基因作為遺傳標(biāo)記，并且利用G418篩選轉(zhuǎn)化子，所以需將3個(gè)突變株中KanMX基因敲除。Cre/loxP報(bào)告基因挽救系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)上述剔除重組菌株標(biāo)記基因KanMX的目的。因?yàn)楸狙芯克捎玫腒anMX表達(dá)盒兩端帶有兩個(gè)同向的重復(fù)序列l(wèi)oxP，利用pGAPza質(zhì)粒上Cre重組酶基因可以識(shí)別兩個(gè)loxP位點(diǎn)，切除中間的連接部分，再把兩個(gè)loxP位點(diǎn)的剩余部分連接在一起，從而實(shí)現(xiàn)KanMX篩選標(biāo)記的敲除。

篩選標(biāo)記的去除：將pGAPza質(zhì)粒用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化到含有KanMX抗性基因的釀酒酵母菌株中，涂布于含100μg/mL的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培養(yǎng)36 h。挑取長勢(shì)較好的菌落接入到半乳糖誘導(dǎo)液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 h，稀釋涂布在YEPD平板上。挑出單菌落點(diǎn)接于YEPD上，再影印到含有G418抗性的YEPD平板上。在YEPD上生長而在含有G418的平板上不生長的菌株即為KanMX抗性基因敲除的菌株。提取酵母基因組，并通過PCR驗(yàn)證KanMX抗性基因是否敲除。

過表達(dá)ATF1基因突變株的構(gòu)建：去除重組菌α5ΔACH1，α5-A1和α5-A2中的KanMX篩選標(biāo)記，得到重組菌α5ΔACH1-K，α5-A1-K和α5-A2-K。將構(gòu)建好的Yep-ATF1質(zhì)粒用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入α5中，α5ΔACH1-K，α5-A1-K和α5-A2-K中，挑取轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證，得到重組菌株α5-ATF1、ΔA-ATF1、A1-ATF1及A2-ATF1。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

基因ACS1和ACS2的表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-FQ-PCR）測(cè)定。重組菌株α5-A1和α5-A2 30℃液體培養(yǎng)12 h。用酵母RNA試劑盒提取信使RNA（mRNA），以mRNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementaryDNA，cDNA），以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃，5s；60℃，30s；72℃，45s；40個(gè)循環(huán)。以肌動(dòng)蛋白基因（ACT1）為內(nèi)參基因，合成引物ACS1-F/ACS1-R、ACS2-F/ACS2-R和ACT1-F/ACT1-R（見表1）。

1.3.3 生長曲線的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用比濁法測(cè)定菌體的生長曲線。從YEPD斜面上挑取1環(huán)酵母菌接入裝液量為50 mL/250 mL YEPD中，30℃靜置培養(yǎng)12 h。然后按照10%的比例接入裝液量為100 mL/500 mL YEPD的三角瓶中，30℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h取出1 mL菌液，5 000 r/min離心5 min，棄清液，蒸餾水洗滌兩次后，稀釋到最終的OD600nm值在1以內(nèi)。以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定其在波長600 nm處的吸光度值。

1.3.4 CO2排放量、還原糖、酒精度的測(cè)定

CO2排放量、還原糖和酒精度的測(cè)定分別采用稱重法、斐林試劑法和酒精計(jì)比重法[14]。

1.3.5 乙酸乙酯的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后蒸餾發(fā)酵液得到含有乙酸乙酯的待測(cè)樣品，采用GC法檢測(cè)乙酸乙酯的含量[15]。檢測(cè)條件為：Agilent 1909N-213毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)儀（flame ionization detector，F(xiàn)ID）；進(jìn)樣口的溫度設(shè)置為200℃；檢測(cè)器的溫度為200℃；進(jìn)樣量為1 μL；分流比為5∶1；載氣為高純度氮?dú)猓∟2），流速為2.0 mL/min。升溫程序：起始柱溫設(shè)置為50℃，保持8 min，再以5℃/min的升溫速度上升至120℃，保持5 min。

1.3.6 乙酰輔酶A含量的測(cè)定

樣品制備：取10mL發(fā)酵液以8000r/min、4℃離心10min，0.25 mol/L pH 5磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）1 mL洗兩次，8 000 r/min、4℃離心10 min，去上清，用1 mL 6%高氯酸重懸，逐滴加入0.3 mol/L的碳酸鉀溶液進(jìn)行鹽沉淀（添加的過程中漩渦振蕩使其充分混勻），調(diào)節(jié)pH值為3.0，12 000 r/min、4 ℃離心10 min除去高氯酸鉀（KClO4）晶體。

上清液轉(zhuǎn)移到EP管中，用0.22 μm針頭式過濾器過濾，然后進(jìn)行乙酰輔酶A含量的高效液相色譜法分析，其檢測(cè)條件[16]為：ZORBAX Eclipse PlusC18色譜柱（250m×4.6 mm×5 μm）；流動(dòng)相為0.2 mol/L的磷酸鈉緩沖液（A）90%和乙腈（B）10%；流速1 mL/min；柱溫25℃；紫外檢測(cè)波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.7 乙酰輔酶A合成酶酶活的測(cè)定

乙酰輔酶A合成酶活力的測(cè)定參考KUANG Y等[17]的方法，反應(yīng)混合液（1 mL）包含100 μmol Tris-HCl緩沖液（pH8.0），5μmol1-萘乙酰胺（1-naphthaleneacetamide，NAD）+，0.1 μmol CoA，5 μmol蘋果酸，150 U蘋果酸脫氫酶，2.75 U檸檬酸合酶，10 μmol乙酸鉀，10 μmol三磷酸腺苷ATP以及適量的粗酶液，30℃反應(yīng)（反應(yīng)時(shí)間20 min），測(cè)定在波長340 nm處吸光度值的變化。

乙酰輔酶A酶合成酶活力定義：每分鐘催化底物生成1 μmol的NADH為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.8 重組菌株的表達(dá)

從YEPD斜面上挑取1環(huán)突變菌種分別接入含5 mL一級(jí)種子培養(yǎng)基的試管中，30℃靜置培養(yǎng)24 h，進(jìn)入穩(wěn)定期后，按照10%的接種量將其接種到含45 mL二級(jí)種子培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)16～17 h，按照10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，不添加前體乙醇和乙酸，30℃靜置發(fā)酵96 h，每隔12 h稱質(zhì)量1次，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定CO2排放量、酒精度、發(fā)酵液殘余還原糖、乙酸乙酯的含量、乙酰輔酶A含量及乙酰輔酶A合成酶酶活，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACH1基因缺失對(duì)乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量的影響

出發(fā)菌株α5和突變株α5ΔACH1用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，不添加酒精和乙酸，發(fā)酵96 h后，測(cè)定發(fā)酵液中乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，突變株α5ΔACH1乙酸乙酯生成量為11.90 mg/L，比出發(fā)菌株α5增加了10.59%；突變株α5ΔACH1的乙酰輔酶A含量比出發(fā)菌株α5增加了52.5%。結(jié)果表明，ACH1基因缺失可以減少乙酰輔酶A的分解，從而提高乙酸乙酯的產(chǎn)量。

圖3 突變株α5ΔACH1和出發(fā)菌株α5乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量Fig.3 Production of ethyl acetate production and acetyl-CoA contents of mutant strain α5ΔACH1 and original strain α5

2.2 過表達(dá)ACS1和ACS2基因?qū)σ宜嵋阴ド闪亢鸵阴］o酶A含量的影響

（1）生長曲線的測(cè)定

測(cè)定出發(fā)菌株α5和重組菌株α5ΔACH1、α5-A1、α5-A2的生長曲線，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，重組菌株α5-A1與出發(fā)菌株α5的生長速率基本一致。菌株α5-A2表現(xiàn)出最高的生長速度和生物量，最大生物量為OD600nm值為17.60，菌株α5ΔACH1的最終生物量低于出發(fā)菌株，說明ACH1基因敲除影響酵母菌株的正常生長。

圖4 菌株α5ΔACH1、α5-A1、α5-A2和α5的生長曲線Fig.4 Growth curves of strain α5ΔACH1,α5-A1,α5-A2 and α5

（2）乙酸乙酯及乙酰輔酶A含量的測(cè)定

將出發(fā)菌株α5和重組菌株α5-A1和α5-A2用發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵96 h后，測(cè)定菌株乙酸乙酯的生成量和乙酰輔酶A含量，并用雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，重組菌株α5-A1和α5-A2的乙酸乙酯產(chǎn)量分別為13.57mg/L和13.31mg/L，分別比突變菌株α5ΔACH1提高14.03%和11.85%，比出發(fā)菌株α5增加26.12%和23.70%。結(jié)果表明，過表達(dá)ACS1基因和ACS2基因可以提高酵母細(xì)胞中乙酸乙酯的合成，且ACS1基因比ACS2基因的過表達(dá)更有利于乙酸乙酯含量的提高。

圖5 菌株α5、α5ΔACH1、α5-A1和α5-A2乙酸乙酯生成量和乙酰輔酶A含量Fig.5 Production of ethyl acetate production and acetyl-CoA contents of strain α5,α5ΔACH1,α5-A1 and α5-A2

突變株α5-A1和α5-A2乙酰輔酶A含量比突變株α5ΔACH1分別提高了80.33%和52.79%，比出發(fā)菌株α5分別提高了175.00%和133.25%。結(jié)果表明，工程菌株過表達(dá)ACS1基因和ACS2基因可以提高酵母細(xì)胞中乙酰輔酶A含量。

（3）基因表達(dá)水平及乙酰輔酶A合成酶酶活力測(cè)定

為了分析重組菌株中ACS1和ACS2基因的轉(zhuǎn)錄水平，分別測(cè)定了出發(fā)菌株α5和重組菌株α5-A1和α5-A2的基因轉(zhuǎn)錄水平差異，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在重組菌株α5-A1中，ACS1基因的表達(dá)水平是出發(fā)菌株α5的3.3倍，在重組菌株α5-A2中，ACS2基因的表達(dá)水平是出發(fā)菌株α5的1.9倍。結(jié)果表明，過表達(dá)ACS1和ACS2基因均提高了其轉(zhuǎn)錄水平。

在轉(zhuǎn)錄水平提高的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測(cè)定了菌株α5和重組菌α5-A1和α5-A2的乙酰輔酶A合成酶的酶活力，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，重組菌株α5-A1和α5-A2的乙酰輔酶A合成酶酶活分別比出發(fā)菌株α5提高了1.5倍和1.2倍。結(jié)果表明，過表達(dá)ACS1和ACS2基因后，乙酰輔酶A合成酶酶活均提高，且過表達(dá)ACS1比過表達(dá)ACS2基因的酶活高。

圖6 菌株α5、α5ΔACH1、α5-A1和α5-A2基因表達(dá)水平和乙酰輔酶A合成酶酶活Fig.6 Gene expression levels and acetyl-CoA synthesis activity of strain α5,α5ΔACH1,α5-A1 and α5-A2

2.3 過表達(dá)ATF1基因?qū)σ宜嵋阴ド闪康挠绊?/h3>

（1）CO2排放量、還原糖和酒精度的測(cè)定

將過表達(dá)ATF1基因的 菌 株α5-ATF1、ΔA-ATF1、A1-ATF1及A2-ATF1，以及親本菌株α5在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵96 h后測(cè)定CO2排放量、還原糖和酒精度，結(jié)果見表2。由表2可知，在相同發(fā)酵條件下，與出發(fā)菌株α5相比，除α5-ATF1的CO2排放量外，其他重組菌的CO2排放量、還原糖和酒精度基本無太大的變化，結(jié)果表明，過表達(dá)ATF1基因?qū)甑陌l(fā)酵性能基本沒有明顯的影響。

表2 出發(fā)菌株和重組菌株發(fā)酵性能的比較Table 2 Comparison of the fermentation performance of the original strain and recombination strains

（2）乙酸乙酯生成量的測(cè)定

出發(fā)菌株與重組菌株乙酸乙酯的生成量測(cè)定結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，單獨(dú)過表達(dá)ATF1基因α5-ATF1菌株產(chǎn)生的乙酸乙酯為對(duì)照菌株α5的315.09%，重組菌A1-ATF1乙酸乙酯生成量最高，達(dá)到72.52 mg/L，是重組菌α5-ATF1的204.14%，重組菌A2-ATF1乙酸乙酯生成量為44.80 mg/L，是重組菌α5-ATF1的125.67%，重組菌重組菌ΔA-ATF1比α5-ATF1產(chǎn)乙酸乙酯顯著增加。由此可以得出，在提高乙酰輔酶A的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加醇乙?；D(zhuǎn)移酶的活性，可顯著提高乙酸乙酯生成量。

圖7 過表達(dá)ATF1基因菌株乙酸乙酯生成量Fig.7 Ethyl acetate content of the strains with overexpression of ATF1gene

3 結(jié)論

乙酸乙酯是清香型白酒的主體香，一直備受關(guān)注。本研究通過基因工程手段提高釀酒酵母分泌乙酰輔酶A的能力，從而提高乙酸乙酯生成量。通過ACH1基因缺失的α5ΔACH1菌株表達(dá)發(fā)現(xiàn)，乙酰輔酶A含量較親本菌株α5稍有提高，但對(duì)提高乙酸乙酯生成量的效果并不明顯，分析原因可能是ACH1基因定位于線粒體中，其增加的是線粒體中乙酰輔酶A的含量，線粒體中的乙酰輔酶A無法流向乙酸乙酯的合成。在ACH1基因缺失的基礎(chǔ)上，過表達(dá)ACS1和ACS2基因得到工程菌株α5-A1和α5-A2，乙酸乙酯生成量分別比親本菌株α5提高26.12%和23.70%；乙酰輔酶A含量分別比α5ΔACH1提高了80.33%和52.79%；結(jié)果表明，過表達(dá)ACS1和ACS2基因均能提高乙酰輔酶A含量和乙酸乙酯生成量，且乙酸乙酯生成量和胞內(nèi)乙酰輔酶A的增加量呈正相關(guān)。在過表達(dá)ACS1和ACS2基因的基礎(chǔ)上，過表達(dá)醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶ATF1基因得到工程菌株A1-ATF1和A2-ATF1，乙酸乙酯含量分別為72.52mg/L和44.80mg/L，分別是單獨(dú)過表達(dá)ATF1基因a5-ATF1的204.14%和125.67%，且ΔA-ATF1比α5-ATF1產(chǎn)乙酸乙酯顯著增加，結(jié)果表明，在底物乙酰輔酶A充足的條件下，提高醇乙?；D(zhuǎn)移酶活性，能夠提高乙酸乙酯的生成量。本研究為后續(xù)研究釀酒酵母乙酸乙酯的合成奠定了基礎(chǔ)。

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