兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒中晚期糖基化終末產(chǎn)物的抑制作用

陳媛媛，李艷麗，羅 慶，唐詩(shī)淼，馮年捷，趙今月，4，鐘曉凌，吳 茜*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；2.三峽食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 宜昌 443005；3.湖北工業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖北 武漢 430068；4.隨州市二月風(fēng)食品有限公司，湖北 隨州 431518）

非酶糖基化（nonenzymatic glycosylation，NEG）是一系列復(fù)雜的非酶促反應(yīng)，又稱美拉德反應(yīng)（Maillard reaction），是還原糖和游離氨基酸殘基在非酶促條件下反應(yīng)形成Schiff堿和Amadori產(chǎn)物等早期糖基化產(chǎn)物，進(jìn)而經(jīng)過(guò)氧化、重排、交聯(lián)等過(guò)程，形成不可逆的非酶糖基化終產(chǎn)物advanced glycosylation end products，AGEs），也是食品加工、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生的重要反應(yīng)之一[1]。非酶糖基化反應(yīng)在生物體內(nèi)廣泛而緩慢地進(jìn)行著，其可導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能降低和老化，進(jìn)而使機(jī)體組織發(fā)生衰老和病變。AGEs是一組具有熒光性和非熒光性結(jié)構(gòu)的復(fù)雜異質(zhì)產(chǎn)物如Nε-羧甲基賴氨酸（Nε-carboxymethyl lysine，CML），Nε-羧乙基賴氨酸（Nε-carboxyethyl lysine，CEL），戊糖苷，精氨嘧啶（argpyrimidine，ArgP），乙二醛賴氨酸二聚體和甲基乙二醛賴氨酸二聚體等[2]）。外源性AGEs（食品中）是內(nèi)源性AGEs（體內(nèi)）的重要來(lái)源，外源性AGEs約有10%進(jìn)入血液循環(huán)，其中1/3通過(guò)腎臟排出，剩余2/3通過(guò)共價(jià)鍵與組織結(jié)合蓄積在體內(nèi)，進(jìn)而誘發(fā)各種疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、動(dòng)脈粥樣硬化或糖尿病及其眾多并發(fā)癥[3]）。

隨著經(jīng)濟(jì)全球化發(fā)展，啤酒運(yùn)輸儲(chǔ)存周期加長(zhǎng)。已有研究表明，因含有多種氨基酸及碳水化合物，啤酒老化過(guò)程中會(huì)形成種類繁多的α-二羰基化合物并富集大量AGEs。RAKETE S等[4]研究表明，在50℃老化2周的啤酒中乙二醛為4.98 μmol/L，甲基乙二醛為2.2 μmol/L，N-甲酰脯氨酸含量為3.08μmol/L，N-羧甲基脯氨酸為0.37μmol/L（乙二醛和甲基乙二醛為產(chǎn)生AGEs的中間體，N-甲酰脯氨酸和N-羧甲基脯氨酸為AGEs代表物）。目前，工業(yè)上主要采用二氧化硫抑制羰基化合物的形成，從而抑制AGEs，提高啤酒的抗老化能力，但二氧化硫帶有刺激性氣味，會(huì)影響啤酒的口感[5]。其他常見(jiàn)的AGEs抑制劑如氨基胍（aminoguanidine，AG）、二甲雙胍、替尼司坦、維生素B6和肌肽等也都存在一定的副作用，如AG引起胃腸道功能紊亂、破壞肺功能以及引起血管炎等[6]。因此，尋找安全高效的天然AGEs抑制劑已成為本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。已有研究表明，白藜蘆醇等類黃酮化合物對(duì)模擬生理?xiàng)l件下非酶糖化反應(yīng)有較強(qiáng)的抑制作用[7]。

原花青素廣泛存在于植物界，是目前國(guó)際上公認(rèn)的最有效的天然抗氧化劑，具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，如降血糖、抗癌、抗衰老和預(yù)防心血管疾病等。原花青素具有較強(qiáng)的抗氧化活性，因此對(duì)AGEs具有潛在的抑制作用。自然界中的原花青素由不同數(shù)量的（+）-兒茶素（catechin，CC）、（-）-表兒茶素（epicatechin，EC）及其衍生物結(jié)合而成，因單體連接方式的不同，可分為A-型（C2-O-C7或C2-O-C5連接）和B-型（C4-C8或C4-C6連接）兩種[8]。由于聚合度、縮合鍵位以及聚合物立體構(gòu)象不同，原花青素的抗氧化活性各不相同。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)都是基于模擬體系進(jìn)行的研究，然而，在真實(shí)食品體系中對(duì)原花青素抑制AGEs的報(bào)道甚少，本研究對(duì)此進(jìn)行了初探，利用啤酒老化體系來(lái)研究不同構(gòu)象原花青素單體對(duì)啤酒老化過(guò)程中產(chǎn)生AGEs的抑制作用，這對(duì)于保障啤酒銷售過(guò)程中的安全和消費(fèi)者的健康至關(guān)重要，從而進(jìn)一步促進(jìn)了我國(guó)啤酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒（清爽8度330 mL聽(tīng)裝）：華潤(rùn)雪花啤酒（中國(guó)）投資有限公司；兒茶素、表兒茶素、甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、三氟乙酸（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氨基胍鹽酸鹽：上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）：上海源葉生物科技有限公司；碳酸氫鈉、福林酚、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸（85%）、乙醇、葡萄糖、麥芽糖、磷酸二氫鈉、沒(méi)食子酸：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司；疊氮鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；羧甲基賴氨酸（純度98%）：加拿大TRC公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑無(wú)特殊說(shuō)明，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME55電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CT15RE離心機(jī)：日本日立公司；XW-80A微型渦旋混合儀：上海瀘西分析儀器廠有限公司；UV-1601紫外可分光光度計(jì)：北京瑞麗分析儀器有限公司；SB-5200DT超聲波清洗劑：寧波新芝生物科技股份有限公司；RF5301熒光分光光度計(jì)：日本島津公司；TSQ ENDURA高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo公司；RE-111旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的配制

750 mL啤酒經(jīng)超聲波清洗儀除去氣泡后，加入0.146 g疊氮鈉（3 mmol/L，抑菌劑）。準(zhǔn)確稱取0.025 g的CC或EC，用超聲后的啤酒分別定容至50mL，作為CC或EC母液，質(zhì)量濃度為0.50mg/mL。將母液用啤酒稀釋成不同質(zhì)量濃度的反應(yīng)液，最后使反應(yīng)液中CC或EC質(zhì)量濃度分別為0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL和 0.30 mg/mL，反應(yīng)液總體積為5 mL。本實(shí)驗(yàn)用加入相同濃度AG的反應(yīng)液作為陽(yáng)性對(duì)照組，不加原花青素不加熱反應(yīng)液作為空白組，不加原花青素反應(yīng)液作為對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)平行。將反應(yīng)液分別裝入10 mL帶蓋玻璃瓶中，在50℃培養(yǎng)箱分別避光孵育，分別于2 d和5 d進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 兒茶素及表兒茶素對(duì)啤酒老化過(guò)程中熒光性AGEs生成的抑制效果

取0.4 mL反應(yīng)液需迅速置于冰水浴中，以防止反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，再加入相應(yīng)pH（pH 4.5）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（以防止熒光猝滅效應(yīng)）稀釋20倍。稀釋后的反應(yīng)液用熒光分光光度計(jì)（激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440nm，入射和出射狹縫寬度為5nm，電壓為700V）測(cè)定其熒光吸收強(qiáng)度。用上述方法測(cè)得的熒光強(qiáng)度，取平均值后用以下公式對(duì)抑制率進(jìn)行計(jì)算：式中：F樣品為加入原花青素且加熱反應(yīng)液稀釋后的熒光強(qiáng)度；F對(duì)照為不加原花青素且加熱反應(yīng)液稀釋后的熒光強(qiáng)度；F空白為不加原花青素且不加熱反應(yīng)液稀釋后的熒光強(qiáng)度。

1.3.3 兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒中蛋白含量的影響

采用李志江[9]的方法，進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷摹Ｈ?5℃、6 000 r/min條件下離心15 min的上清液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，充分混合均勻，放置2～3 min，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)595 nm處進(jìn)行比色。

1.3.4 兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒中總酚含量的影響

采用趙曉娟等[10]的方法，進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷?。?.05 mL離心后反應(yīng)上清液于帶塞試管中，加入0.45 mL pH 4.5的PBS，將其稀釋10倍后加入2.5 mL 10%福林酚溶液，充分混勻，再依次加入1 mL 15%碳酸鈉溶液和1 mL蒸餾水，混勻后避光反應(yīng)1h。反應(yīng)液用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)760nm處進(jìn)行比色，參比溶液將1mL樣品替換成1mLpH4.5的PBS。

1.3.5 兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒色度的影響

將離心后反應(yīng)上清液注入10 mm玻璃比色皿中，以蒸餾水為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)為430 nm處測(cè)量其吸光度值，換算成EBC色度公式[11]如下：

色度（EBC）=10×1.27×A430nm-1.2

1.3.6 兒茶素及表兒茶素對(duì)啤酒老化過(guò)程中CML生成的HPLC-MS/MS分析檢測(cè)[12-14]

稱取1.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL棕色容量瓶中，用去離子水配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃下保存。檢測(cè)時(shí)用去離子水稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的CML標(biāo)準(zhǔn)工作液。通過(guò)逐級(jí)稀釋得到不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液，CML標(biāo)樣質(zhì)量濃度分別為：0.01 μg/mL，0.05 μg/mL，0.10μg/mL，0.25μg/mL、0.50μg/mL。過(guò)水相濾膜，待HPLCMS/MS分析檢測(cè)。

取0.5 mL反應(yīng)液加入0.5 mL硼氫化鈉溶液（0.2 mol/L，pH 13～14）還原，得到乳濁劑，樣品在4℃還原10 h后，在4℃、15000r/min條件下離心60min，收集上清液。取0.5mL上清液通過(guò)預(yù)活化后的PCX固相萃取柱（預(yù)活化條件：依次3 mL蒸餾水和3 mL蒸餾水沖洗柱芯），再依次用3 mL蒸餾水3 mL甲醇沖洗。用甲醇（含5%氨水）洗脫出目標(biāo)化合物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇后復(fù)溶于2 mL 0.1%的甲酸水溶液中，分析前通過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，待HPLC-MS/MS分析檢測(cè)。

高效液相色譜條件：流動(dòng)相A為0.02%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，進(jìn)樣量10 μL，流速為0.2 mL/min，柱溫30℃，梯度洗脫條件為0～0.5 min為90%A，0.5～4.0 min為90%～60%A，運(yùn)行時(shí)間為14 min。

質(zhì)譜條件：正離子電噴霧離子化（electrospray ionizaion，ESI+）；離子源溫度為300 ℃；毛細(xì)管電壓為4 kV；一級(jí)質(zhì)譜四級(jí)桿溫度和二級(jí)質(zhì)譜四級(jí)桿溫度均為100℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式的設(shè)置為m/z205.0→m/z84.22，m/z205.0→m/z130.11。

1.3.7 分子對(duì)接

在ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//zinc.docking.org）中下載兒茶素和表兒茶素的分子結(jié)構(gòu)模型（ID：119983和119988）。CML的晶體結(jié)構(gòu)由Sybyl 2.1.1軟件畫出。再用Tripos力場(chǎng)和Gasteiger-Huckell電荷優(yōu)化分子的幾何結(jié)構(gòu)。用Sybyl 2.1.1軟件對(duì)CML分別與兒茶素和表兒茶素進(jìn)行了分子對(duì)接。在對(duì)接過(guò)程中，考慮了化合物的20個(gè)構(gòu)象，取對(duì)接打分最高的進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)分析

采用SPSS v21.0軟件進(jìn)行相關(guān)性和顯著性分析，所有樣品進(jìn)行3次測(cè)定（n=3），結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（X±SD）表示，兩組數(shù)據(jù)間顯著性差異表示為P＜0.05。繪圖通過(guò)OriginPro 8.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素及表兒茶素對(duì)啤酒老化過(guò)程中熒光性AGEs生成的抑制效果

不同原花青素低聚體對(duì)啤酒老化產(chǎn)生AGEs抑制效果如圖1所示，CC、EC及AG對(duì)AGEs的抑制效果隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，呈劑量依賴性且有顯著性影響（P＜0.05）。老化2 d抑制率達(dá)到最大，CC可達(dá)到（62.27±2.80）%，EC可達(dá)到（54.99±0.441）%。由圖1A可知，老化2 d后，CC對(duì)老化啤酒中AGEs的生成的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為（0.211±0.015）mg/mL，EC的IC50為（0.270±0.022）mg/mL，AG的IC50為（0.497±0.009）mg/mL。由圖1B可知，CC對(duì)啤酒中AGEs的生成的IC50為（0.289±0.008）mg/mL，EC的IC50為（0.329±0.018）mg/mL，AG的IC50為（0.552±0.010）mg/mL。結(jié)果表明，在啤酒分別老化2 d和5 d后，CC及EC比陽(yáng)性對(duì)照AG抑制同期老化產(chǎn)生的AGEs的作用要強(qiáng)。并且，CC的抑制作用比EC強(qiáng)。對(duì)于多酚類物質(zhì)抑制AGEs機(jī)制，國(guó)外有研究報(bào)道[20]稱，多酚類物質(zhì)具有清除自由基的能力，抑制了AGEs形成的中間階段，即多酚類物質(zhì)捕獲美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物—Amadori產(chǎn)物（如α-二羰基化合物），從而阻止了AGEs的形成。

圖1 不同含量的兒茶素及表兒茶素對(duì)啤酒老化2 d(A)及5 d(B)過(guò)程中AGEs生成的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of different concentrations of CC and EC on AGEs production during beer aging process for 2 d(A)and 5 d(B)

2.2 兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒中蛋白含量的影響

由表1可知，加入高濃度的原花青素老化啤酒的蛋白含量會(huì)稍大于加入低濃度原花青素的，是由于測(cè)量樣品數(shù)較大，每個(gè)樣品反應(yīng)的時(shí)間有差異。反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則染液蛋白復(fù)合物會(huì)形成可見(jiàn)的沉淀，吸光度值會(huì)降低，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的精確性[15]。隨著啤酒的老化，美拉德反應(yīng)的加劇，啤酒中的蛋白一部分成為糖化蛋白，一部分與多酚耦合形成絮狀沉淀，但是總含量不變，因此不同濃度的原花青素對(duì)老化啤酒中蛋白的含量沒(méi)有顯著性影響（P＞0.05）。

表1 不同含量的兒茶素及表兒茶素對(duì)啤酒老化過(guò)程中蛋白含量的影響Table 1 Effects of different concentrations of CC and EC on protein contents during beer aging process

2.3 兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒中總酚含量的影響

表2 不同含量的兒茶素及表兒茶素對(duì)啤酒老化過(guò)程中總酚含量的影響Table 2 Effects of different concentrations of CC and EC on total phenols contents during beer aging process

大麥和酒花是啤酒中多酚的重要來(lái)源，其中80%左右來(lái)源于大麥，20%左右來(lái)源于酒花[16]。由表2可知，啤酒中本身含有的總酚含量為（0.211±0.001）mg/mL，隨著添加的CC和EC質(zhì)量濃度的增大，啤酒中總酚含量隨之增大，且有顯著性差異（P＜0.05）。添加量為0.30 mg/mL時(shí)，啤酒的總酚含量達(dá)到最大，第0、2、5天加入CC老化啤酒總酚含量最高分別可達(dá)（0.564±0.035）mg/mL、（0.558±0.024）mg/mL、（0.560±0.019）mg/mL。第0、2、5天加入EC老化啤酒總酚含量最高可達(dá)（0.561±0.021）mg/mL、（0.564±0.025）mg/mL、（0.556±0.006）mg/mL。

2.4 兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒色度的影響

由表3可知，隨著啤酒的老化，不加抑制劑的啤酒色度由最初（0.756±0.034）EBC增加至（4.185±0.008）EBC，這是由于啤酒在老化過(guò)程中美拉德反應(yīng)加劇，顏色加深。加入原花青素后，啤酒色度隨抑制劑濃度的增大而增大，且有顯著性變化（P＜0.05）。第5天時(shí)，加入了CC的老化啤酒，色度達(dá)到最大（6.534±0.007）EBC，是最初色度的1.5倍，因?yàn)槠渌芤涸诩訜釛l件下溶液通過(guò)縮合形成無(wú)定型鞣質(zhì)，鞣質(zhì)在溶液中容易被氧化，顏色變暗[17]，增加了啤酒的色度。而陽(yáng)性對(duì)照AG添加量對(duì)啤酒色度無(wú)顯著性影響（P＜0.05）。

表3 不同含量的兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒色度的影響Table 3 Effects of different concentrations of CC and EC on the chromaticity during beer aging process

2.5 兒茶素及表兒茶素對(duì)啤酒老化過(guò)程中CML生成的抑制

經(jīng)計(jì)算得Nε-羧乙基賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=-211 445.3+3 782 080x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，CML的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜解析，得到定性和定量離子碎片m/z=84.2和130.1。由圖3可知，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增大，對(duì)CML抑制效果越好，且EC的抑制效果要好于CC的抑制效果。CC對(duì)其抑制率最大可達(dá)（8.67±0.23）%，EC對(duì)其抑制率最大可達(dá)（9.68%±0.83）%。

圖2 應(yīng)用HPLC-MS/MS法檢測(cè)Nε-羧甲基賴氨酸的離子質(zhì)譜圖(A)及色譜圖(B)Fig.2 Ion mass spectrogram(A)and chromatogram(B)for Nε-carboxy methyl lysine analysis by HPLC-MS/MS

圖3 不同的兒茶素及表兒茶素對(duì)老化啤酒中Nε-羧甲基賴氨酸的抑制效果Fig.3 Inhibition effects of different concentrations of CC and EC on Nε-carboxy methyl lysine during beer aging process

2.6 分子對(duì)接

CC/EC與CML的分子對(duì)接結(jié)果如圖4所示，經(jīng)軟件計(jì)算CML與CC對(duì)接打分為1.006 9，CML與EC對(duì)接打分為1.514 2，說(shuō)明表兒茶素與CML結(jié)合時(shí)所需的自由能更低，更易與CML結(jié)合，以致EC抑制CML的效果比CC好。

圖4 兒茶素及表兒茶素與Nε-羧甲基賴氨酸分子對(duì)接結(jié)果Fig.4 Molecular docking results between CC and Nε-carboxyethyl lysine,EC and Nε-carboxy methyl lysine

3 討論

啤酒在長(zhǎng)期儲(chǔ)存的過(guò)程中會(huì)發(fā)生老化，不僅影響了啤酒的風(fēng)味，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生AGEs，危害人體的健康。原花青素是一種天然抗氧化劑，但作為食品添加劑的應(yīng)用報(bào)道較少。WU Q等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在模擬生理環(huán)境條件下，對(duì)低聚原花青素與AG的抑制效果進(jìn)行了比較，相同質(zhì)量濃度（1 mg/mL）時(shí)，低聚原花青素抑制率為（111.26±0.43）%，AG抑制率為（57.20±1.96）%，低聚原花青素的抑制效果明顯高于AG。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，在模擬啤酒老化過(guò)程中，加入原花青素對(duì)老化過(guò)程中產(chǎn)生熒光性AGEs的作用呈劑量依賴性，且在老化第2天和第4天后，原花青素的抑制效果都要比AG好，并且兒茶素的抑制效果要稍好于表兒茶素的效果。在YOKOZAWA T等[19]的研究中得到了相似的結(jié)果，CC和EC抑制BSA-葡萄糖（果糖）反應(yīng)體系中的熒光性AGEs的能力高于AG（pH7.4，37℃孵育14 d），并且CC的抑制效果要好于EC。說(shuō)明原花青素是代替AG的良好天然AGEs抑制劑。本實(shí)驗(yàn)對(duì)原花青素對(duì)啤酒非生物穩(wěn)定性作出探討，在老化過(guò)程中，原花青素對(duì)啤酒蛋白含量無(wú)顯著影響，對(duì)啤酒總酚含量呈劑量依賴性，原花青素含量越高啤酒顏色越深。用分子對(duì)接闡述了CC和EC對(duì)與CML的結(jié)合情況，結(jié)果得出，EC抑制CML的效果比兒茶素強(qiáng)是由于在與CML結(jié)合時(shí)所需的自由能更低。本實(shí)驗(yàn)研究了原花青素抑制啤酒老化過(guò)程中產(chǎn)生的AGEs，為原花青素作為食品添加劑提供了新思路，同時(shí)也可以提高對(duì)天然產(chǎn)物的開發(fā)和利用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探究了原花青素抑制啤酒老化過(guò)程中產(chǎn)生AGEs的情況，不同濃度的原花青素加入啤酒中，老化2 d和5d后，對(duì)啤酒中熒光性AGEs抑制效果CC＞EC＞AG。對(duì)啤酒蛋白含量無(wú)顯著影響（P＞0.05），對(duì)啤酒總酚和色度有顯著性影響（P＜0.05），且呈劑量依賴性。對(duì)CML的抑制效果為EC＞CC。

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