可高效降解甜高粱秸稈產(chǎn)糖的纖維素酶研究

許富強(qiáng)，王曙陽*，董妙音，姜伯玲，李蕎蕎，陳積紅，3，李文建，3

（1.中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.甘肅省輻照誘變育種工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 武威 733001）

近年來，隨著化石能源的過度開采和利用，傳統(tǒng)能源日益緊缺并將枯竭，能源問題已成為全社會(huì)所面臨的首要難題。到2050年，全球每年的石油供應(yīng)量將由目前的25億桶降至不足5億桶，嚴(yán)重威脅人類社會(huì)的生存和發(fā)展，因此越來越多的科學(xué)家致力于探究新的能量來源以緩解能源危機(jī)[1]。全世界每年光合作用產(chǎn)生的植物體干物質(zhì)達(dá)1 500億t，其中作為自然界中十分豐富的資源，纖維素及半纖維素的含量占了50%以上[2]，如常見的作物秸稈、飼草、甘蔗渣中都富含纖維素[3]，若能利用纖維素酶將這些纖維素轉(zhuǎn)化成可以被直接或間接利用的糖類[4-5]，再借助生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[6-7]等能源物質(zhì)，將實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素的有效利用，緩解能源短缺問題[8]。纖維素酶廣泛應(yīng)用于飼料、食品工業(yè)以及紡織業(yè)、造紙業(yè)和洗滌業(yè)領(lǐng)域，技術(shù)已經(jīng)比較成熟[9]，但在燃料酒精生產(chǎn)方面存在諸多挑戰(zhàn)，如高效的酶水解體系的建立[10]、高產(chǎn)纖維素酶菌株的構(gòu)建及高酶活纖維素酶液的制備[11-12]。

本研究通過測定5組實(shí)驗(yàn)室自制的纖維素酶液的濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA）、其分解微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）后產(chǎn)生的還原糖含量以及對(duì)甜高粱秸稈纖維素的轉(zhuǎn)化率，與商品纖維素酶作比較，從而優(yōu)選出一種可高效降解甜高粱秸稈的纖維素酶，以期為后續(xù)纖維素酶分解甜高粱秸稈產(chǎn)生葡萄糖，進(jìn)而為發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇提供論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜高粱秸稈：以種植于中國科學(xué)院近代物理研究所武威現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)園的甜高粱秸稈為供試材料，待其成熟，用五點(diǎn)取樣法采樣，樣品于105℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，冷卻至室溫后用粉碎機(jī)粉碎，過20目篩備用。

纖維素酶液：實(shí)驗(yàn)所用的纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ、纖維素酶Ⅴ均由中國科學(xué)院近代物理研究所微生物實(shí)驗(yàn)室用重離子輻照誘變處理過的綠色木霉（Trichoderma viride）和黑曲霉（Aspergillus niger）突變體采取5種不同的發(fā)酵工藝進(jìn)行中試發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)物先經(jīng)6層紗布過濾后，于4℃、4000r/min條件下離心10 min，上清液即為纖維素酶液[13]；商品纖維素酶：山東隆科特酶制劑有限公司。

微晶纖維素：香港BBI Life Sciences有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）：上海中秦化學(xué)試劑有限公司；十六烷三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）：美國SPECTRUM公司；濃H2SO（4純度為98%）、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉：天津北辰方正試劑廠；葡萄糖：天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GUJS-10-100AUTOBIO2000機(jī)械攪拌發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司；Bioteck酶標(biāo)儀：時(shí)代聯(lián)想生物科技有限公司；5417R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國Kendro公司；Milli-Q Direct8純水/超純水一體化系統(tǒng)：默克化工技術(shù)有限公司；06粗纖維測定儀：濟(jì)南儀器盛泰有限公司；MB-102振蕩型恒溫金屬浴：杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

DNS試劑與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和光吸收值成比例關(guān)系，用酶標(biāo)儀測出反應(yīng)后的吸光度值可得還原糖含量[14]。具體操作如下：準(zhǔn)確配制1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別取不同質(zhì)量濃度的葡萄標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL于1.5mL的離心管中，依次加入40μL蒸餾水和140μLDNS試劑，使體系總體積為200μL，在95℃、300 r/min的金屬浴上孵化5 min，立即冷卻后取出40 μL加入到含有160 μL蒸餾水的酶標(biāo)板中，在波長520 nm處用酶標(biāo)儀測其值。以吸光度值OD520nm（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫縱標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=4.122x-0.378 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算水解體系中還原糖含量。

1.3.2 纖維素酶濾紙酶活的測定

濾紙的聚合度和結(jié)晶度相較于其他纖維材料來說處于“中等”程度，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常以其為原料經(jīng)纖維素酶水解生成還原糖的量來衡量纖維素酶總的糖化能力，它反映了纖維素酶中內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶三個(gè)酶組分的協(xié)同作用能力，統(tǒng)稱濾紙酶活[15-16]。具體操作：在1.5 mL的離心管中加入3 mm×4 mm的濾紙塊，再加入40 μL pH=4.6的檸檬酸鈉緩沖液和20 μL纖維素酶液，在50℃金屬浴上300 r/min孵育60 min后加入140 μL DNS試劑，在95 ℃金屬浴上300 r/min孵化5 min，冷卻后取出40 μL加入含有160 μL蒸餾水的酶標(biāo)板中，在波長520 nm處用酶標(biāo)儀測其OD520nm值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線方程計(jì)算還原糖含量，根據(jù)纖維素酶酶活定義得FPA酶活[17]。

纖維素酶酶活定義：以每毫升酶液在1 min內(nèi)水解反應(yīng)體系中底物生成每微克葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U）。

1.3.3 纖維素酶分解微晶纖維素實(shí)驗(yàn)

微晶纖維素（MCC）在結(jié)構(gòu)上是以β-1,4-葡萄糖苷鍵結(jié)合的直鏈形式多糖，它由天然纖維素經(jīng)水解至極限聚合度得到的，故與纖維素在化學(xué)反應(yīng)特性上具有相類似的特點(diǎn)[18]，因此在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，可以用纖維素酶分解微晶纖維素產(chǎn)生葡萄糖的量來衡量纖維素酶分解纖維素的能力。MCC的分解實(shí)驗(yàn)參照BOMMARIUS A S等[19]研究方法，取100 mg/mL的微晶纖維素溶液5 mL，pH 5.0的檸檬酸鈉緩沖液2 mL，酶液1 mL，在50℃、200 r/min的搖床上反應(yīng)8 h。反應(yīng)畢，測定微晶纖維素分解實(shí)驗(yàn)中的還原糖含量。具體操作為：反應(yīng)液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后，取60 μL上清液，加入140μLDNS溶液，在95℃金屬浴上加熱5min，冷卻至室溫后，取40 μL加入含有160 μL蒸餾水的酶標(biāo)板中，在波長520 nm處進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測。

1.3.4 纖維素酶分解甜高粱秸稈的實(shí)驗(yàn)

甜高粱秸稈中纖維素的含量的測定：纖維素的含量通過酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）減去酸性洗滌木質(zhì)素（acid detergent lignin，ADL）可得[20-23]。

甜高粱秸稈由占80%左右的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)容物組成，秸稈的細(xì)胞內(nèi)容物基本上能夠被完全消化，而含有較多纖維素的細(xì)胞壁則很難被降解。由于纖維素極難溶于水，因而纖維素酶和纖維素的作用屬于固-液雙相反應(yīng)。在酶解反應(yīng)時(shí)，作為液相的纖維素酶分子先吸附到固相的纖維素表面上，然后酶和底物形成不穩(wěn)定的復(fù)合物，并在固相表面上進(jìn)行酶水解反應(yīng)從而產(chǎn)生還原糖[24]。具體操作：準(zhǔn)確稱取1 g過20目篩的甜高粱置于培養(yǎng)皿中，按70%的含水量加蒸餾水0.7 mL，分別按30%的酶量，加入纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ、纖維素酶Ⅴ、商品纖維素酶，每組設(shè)置3個(gè)平行，然后于50℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0、24 h、48 h、72 h時(shí)參考國標(biāo)GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測定》[25]用斐林試劑熱滴定法測其還原糖含量[25]。纖維素轉(zhuǎn)化率的計(jì)算公式如下所示：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS21.0進(jìn)行分析，并用Origin8.0進(jìn)行圖表處理，每組設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶濾紙酶活性的測定結(jié)果

5組實(shí)驗(yàn)室自制的纖維素酶和商品纖維素酶的濾紙酶活（FPA）性測定結(jié)果如圖1所示。

圖1 纖維素酶的濾紙酶活測定結(jié)果Fig.1 Determination results of filter paper activity of cellulase

由圖1可知，5組自制纖維素酶的FPA極顯著低于商品纖維素酶的FPA（P＜0.01）。纖維素酶Ⅱ的FPA明顯高于其他4組自制的纖維素酶（P＜0.05），分別是纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ、纖維素酶ⅤFPA的8.05、11.57、2.96、2.63倍。其次，纖維素酶Ⅴ顯著高于纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅲ（P＜0.05），略高于纖維素酶Ⅳ，但不顯著（P＞0.05）。

2.2 纖維素酶對(duì)微晶纖維素分解效果

考察5組實(shí)驗(yàn)室自制的纖維素酶和商品纖維素酶對(duì)微晶纖維素（MCC）的分解效果，結(jié)果如圖2所示。

圖2 纖維素酶的微晶纖維素的分解結(jié)果Fig.2 Decomposition results of microcrystalline cellulose withcellulase

由圖2可知，商品纖維素酶對(duì)MCC的分解能力最強(qiáng)，極顯著強(qiáng)于其他自制的纖維素酶（P＜0.01），纖維素酶Ⅴ次之，顯著強(qiáng)于纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅲ（P＜0.05），且比纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅳ分解MCC的能力略強(qiáng)，但未達(dá)到差異顯著性水平（P＞0.05）。纖維素酶Ⅴ分解MCC的能力分別比纖維素酶Ⅰ、纖維素酶Ⅱ、纖維素酶Ⅲ、纖維素酶Ⅳ的分解MCC能力強(qiáng)14.31倍、0.94倍、6.35倍、1.43倍。這可能是由于不同的纖維素酶液中內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的比例不同，導(dǎo)致其在分解不同結(jié)晶度和聚合度的纖維素時(shí)存在差異。

2.3 纖維素酶對(duì)甜高粱秸稈纖維素的分解效果

酸性洗滌纖維（ADF）包括幾乎全部的纖維素、木質(zhì)素以及少量的酸不溶灰分，酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）常用72%的濃硫酸水解ADF后所得的不容物測得，主要由木質(zhì)素和酸不溶灰分組成，實(shí)驗(yàn)中用ADF含量減去ADL含量表示秸稈中的纖維素的含量，甜高粱秸稈中ADF與ADL含量測定結(jié)果如表1所示。

表1 甜高粱秸稈中酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素含量的測定結(jié)果Table 1 Determination results of ADF and ADL contents in sweet sorghum straw

由表1可知，甜高粱秸稈的酸性洗滌纖維（ADF）含量為44.58g/100 g，酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）含量為6.43 g/100 g，通過本實(shí)驗(yàn)中ADF含量減去ADL含量可測得文中所用的實(shí)驗(yàn)材料甜高粱秸稈的初始纖維素含量為38.16 g/100 g。

用斐林熱滴定法測定0、24 h、48 h、72 h時(shí)反應(yīng)體系中還原糖含量，根據(jù)公式（1）得到纖維素酶對(duì)甜高粱秸稈纖維素的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 纖維素酶降解甜高粱秸稈的纖維素轉(zhuǎn)化率Fig.3 Cellulose conversion ratio of sweet sorghum straw with cellulase

由圖3可知，加入纖維素酶后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長甜高粱秸稈轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，表明5組自制的纖維素酶和商品纖維素酶均能將甜高粱秸稈中的纖維素分解生成還原糖。在0～72h的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，商品纖維素酶對(duì)甜高粱秸稈中纖維素的轉(zhuǎn)化率一直高于5組自制的纖維素酶，在48h時(shí)，商品纖維素酶對(duì)甜高粱秸稈中纖維素的轉(zhuǎn)化率達(dá)到13.52%，之后基本維持不變（P＞0.05）。除了纖維素酶Ⅰ在24 h時(shí)轉(zhuǎn)化率已達(dá)到最高外，其余5組纖維素酶均在48 h之后基本不再降解轉(zhuǎn)化生成葡萄糖，可能的原因有兩點(diǎn)：一是由于反應(yīng)時(shí)間過長，纖維素酶失活導(dǎo)致酶的活性降低[26]；二是產(chǎn)物葡萄糖抑制了纖維素酶的活性[27]。在自制的5組纖維素酶中，0～48 h內(nèi)纖維素酶Ⅴ對(duì)甜高粱秸稈中纖維素的降解能力最強(qiáng)，在48 h時(shí)秸稈中纖維素的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了最高，為11.69%，48h以后轉(zhuǎn)化率基本不變（P＞0.05）。由此可知纖維素酶Ⅴ對(duì)甜高粱秸稈纖維素具有較高的親和力，能高效降解甜高粱秸稈中的纖維素，這在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究意義重大。

目前報(bào)道的纖維素酶對(duì)天然纖維素的降解轉(zhuǎn)化率最高水平是20%[28]，而本實(shí)驗(yàn)室自制的纖維素酶Ⅴ對(duì)甜高粱秸稈纖維素表現(xiàn)出了比較強(qiáng)的降解能力，可見纖維素酶Ⅴ中內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶組分比例平衡，特別是纖維素酶Ⅴ在高效分解甜高粱秸稈纖維素產(chǎn)糖方面表現(xiàn)的巨大潛力，可作為生物質(zhì)能源催化生產(chǎn)的商業(yè)纖維素酶進(jìn)一步推廣生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本研究通過測定重離子誘變技術(shù)選育的綠色木霉和黑曲霉所發(fā)酵生產(chǎn)的5組自制纖維素酶液和商品纖維素酶的濾紙酶活（FPA），及其對(duì)微晶纖維素（MCC）和甜高粱秸稈纖維素的降解效果評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)，在5組自制的纖維素酶液中，濾紙酶活（FPA）最高的是纖維素酶Ⅱ（1364.84U/mL），可制備高濾紙酶活的商品纖維素酶制劑；纖維素酶Ⅴ的濾紙酶活次之（519.83 U/mL），但其對(duì)微晶纖維素和甜高粱秸稈的降解效果均強(qiáng)于纖維素酶Ⅱ，尤其是纖維素酶Ⅴ在50℃、48h時(shí)對(duì)甜高粱秸稈中纖維素降解能力較強(qiáng)，纖維素轉(zhuǎn)化率達(dá)到了11.69%，這對(duì)以甜高粱秸稈為底物酶解產(chǎn)生可發(fā)酵的糖進(jìn)而生產(chǎn)生物乙醇以及高附加值的化工產(chǎn)品意義重大。

[1]CAMBELL C,LAHERRèRE J.The end of cheap oil:Global production of conventional oil will begin to decline sooner than most people think,probably within 10 years[J].Sci Am,1998,3:78-83.

[2]THRAN D,SEIDENBERGER T.Global biomass potentials-resources,drivers and scenario results[J].Energ Sust Dev,2010(10):200-205.

[3]DEUTSCHMANN R,DEKKER R F.From plant biomass to bio-based chemicals:latest developments in xylan research[J].Biotechnol Adv,2012,30(6):1627-1640.

[4]SINNOTT M L.Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer[J].Chem Rev,1990,90(7):1171-1202.

[5]JUTURU V,WU J C.Microbial cellulases:Engineering,production and applications[J].Renew Sust Ener Rev,2014,33(5):188-203.

[6]KUMAR R,SINGH S,SINGH O V.Bioconversion of lignocellulosic biomass:biochemical and molecular perspectives[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35(5):377-391.

[7]彭良才.論中國生物能源發(fā)展的根本出路[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，92（2）：1-6.

[8]BHAT M K.Cellulases and related enzymes in biotechnology[J].Biotechnol Adv,2000,18(5):355-383

[9]GUPTA R,MEHTA G,DESWAL D,et al.Cellulases and their biotechnological applications[J].Biotechnol Environ Manage Res Recov,2013,12:89-106.

[10]BANSAL P,HALL M,REALFF M J,et al.Modeling cellulase kinetics on lignocellulosic substrates[J].Biotechnol Adv,2009,27(6):833-848.

[11]KUHAD C,GUPTA R,SINGH A.Microbial cellulases and their industrial applications[J].Enzyme Res,2011(2):1-9.

[12]姜伯玲.重離子輻照誘變選育纖維素酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵工藝研究[D].北京：中國科學(xué)院大學(xué)，2016.

[13]姜伯玲，王曙陽，李文建，等.綠色木霉與黑曲霉混合發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的研究[J].中國釀造，2015，34（7）：28-31.

[14]ZHAO K,XUE P J,GU G Y.Study on determination of reducing sugar content using 3,5-dinitrosalicylic acid method[J].Food Sci,2008,29(8):534-536.

[15]王義甫，何艷玲，孔令娜.飼用纖維素酶測定方法的探討[J].飼料與畜牧，2008，67（1）：35-38.

[16]張全國，張志萍，趙民善，等.秸稈制氫過程中纖維素酶酶活測定方法研究[J].熱科學(xué)與技術(shù)，2011，10（1）：128-132.

[17]DECKERSR,ADNEYW S,JENNINGS E,et al.Automated filter paper assayfor determination of cellulose activity[J].Biotechnol Fuels Chem,2003,107(1):687-703.

[18]陸紅佳，鄭龍輝，劉 雄.微晶纖維素在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（3）：141-144.

[19]BOMMARIUS A S,KATONA A,CHEBEN S E,et al.Cellulase kinetics as a function of cellulose pretreatment[J].Metab Eng,2008,10(6):370-381.

[20]楊 勝.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1999：16-17.

[21]全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).NY/T 1459—2007飼料中酸性洗滌纖維的測定[S].西安：農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢查測試中心，2007.

[22]全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).GB/T 20805—2006飼料中酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[23]許富強(qiáng)，董妙音，王曙陽，等.甜高粱最佳青貯時(shí)期及延期對(duì)其營養(yǎng)成分的影響研究[J].飼料研究，2017（4）：20-24.

[24]麻星星.天然纖維素酶法水解條件的研究[D].北京：北京化工大學(xué)，2010.

[25]中華人民共和國衛(wèi)生部、中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.7—2008食品中還原糖的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[26]WILSON D B,IRWIN D C.Genetics and properties of cellulases[M].New York:Springer Nature,1999,1-21.

[27]YE S,CHENG J.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production:A review[J].Bioresource Technol,2003,34(1):1-11.

[28]MOOD S H,GOLFESHAN A H,TABATABAEI M,et al.Lignocellulosic biomass to bioethanol,a comprehensive review with a focus on pretreatment[J].Renew Sust Energ Rev,2013,27:77-93.