魚露中耐鹽菌的分離鑒定及發(fā)酵性能比較

伍蓉莉，歐陽信，段 杉*，段星星，翟苗苗，張林靜，凌曉怡，高向陽

（華南農業(yè)大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

魚露一般以魚、蝦等為原料，是在多種微生物共同參與下釀制而成的一種調味品[1]。魚露的發(fā)酵涉及多種微生物的作用，研究表明酵母菌和乳酸菌對其風味有較大影響[2]，耐鹽乳酸菌是其中的優(yōu)勢菌[3]。嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）屬于乳酸菌，革蘭陽氏性球菌，四聯或成對，常存在于高鹽發(fā)酵食品中[4-5]，能在鹽濃度高達25%的條件下生長[6]。中國傳統(tǒng)露天釀造的醬油中存在嗜鹽四聯球菌，其發(fā)酵得到的醬油的安全性被廣大群眾接受。并且研究表明，將嗜鹽四聯球菌與蛋白酶結合，能提高產品風味[7-8]。趙國忠等[9]在醬油釀造過程中添加耐鹽乳酸菌，提高了產品的品質。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）屬乳酸菌之一，產L-乳酸[10]，盡管其安全性尚不明確，但由于它也是從魚露中分離出來的，并且目前不清楚它對魚露風味有何貢獻，所以本文暫時將其與嗜鹽四聯球菌一起進行比較研究。

目前對魚露的研究集中在發(fā)酵工藝[11]、微生物動態(tài)分析[12]、耐鹽機制[13]，但是魚露中不同種的耐鹽乳酸菌發(fā)酵特性如何？同一種但不同株的耐鹽乳酸菌的發(fā)酵特性是否存在差異？這些問題尚不明確，有待進一步研究探討。故本研究從魚露中篩選耐鹽乳酸菌，并進一步比較不同耐鹽乳酸菌的發(fā)酵特性，旨在為今后將耐鹽乳酸菌應用于魚露的發(fā)酵提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

魚露：發(fā)酵中期的魚露，廣東省汕頭魚露廠有限公司提供；藍圓鲹（Decapterus maruadsi），又名巴浪魚：廣州市天河區(qū)長湴綜合市場。

1.1.2化學試劑

牛胰蛋白酶（250 U/mg）：廣州市天河區(qū)；酶制劑：上海源聚生物科技有限公司；復合蛋白酶（120 U/mg）：廣州市天河區(qū)；酶制劑：廣州市天河區(qū)遠天酶制劑廠；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國Zymo Research公司；引物：上海生工生物工程技術服務有限公司；組胺標準品、5′-肌苷酸二鈉（5′-inosinic acid disodium salt hydrate，IMP）標準品、5′-鳥苷酸二鈉（5′-guanylicaciddisodium salthydrate，GMP）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸細菌（MRS）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

T196DNA聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增儀：德國BIOMETRA公司；LC-10AT高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）儀（配SPD-10A紫外檢測器）：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的篩選

以發(fā)酵中期的魚露為原料，用20%的鹽水將魚露樣品稀釋成不同的梯度后分別涂布于用含10%NaCl、0.2%碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基上進行篩選。于30℃有氧培養(yǎng)5 d。挑取產生溶鈣圈的菌落經2～3次分離純化得到單菌落。

1.3.2 菌株的鑒定

形態(tài)學鑒定：將得到的單菌落進行革蘭氏染色并進行形態(tài)學觀察。

分子生物學鑒定：提取G+細菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），利用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）擴增其16SrDNA序列。PCR擴增體系：Taq酶Mix（12.5μL）、模板DNA（2.5μL）、引物27F（1 μL）、引物1492R（1 μL）、dd H2O（8 μL）；PCR擴增條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸l.5 min，72℃延伸10 min，循環(huán)數為30。電泳檢測擴增結果合格后，將PCR擴增產物送廣州生工生物科技有限公司測序，并將測序結果在EzBicloud網站上與模式株比對，利用軟件MEGA 7.0中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 魚肉水解液的制備

將新鮮藍圓鲹切成小塊后打漿，以魚肉∶水∶食鹽∶復合蛋白酶=100∶50∶10∶0.1的質量比混勻后，于60 ℃的水浴鍋中酶解5h，定期用玻璃棒攪拌。再加入0.25%胰蛋白酶（牛胰）及20%的水于37℃條件下繼續(xù)酶解4 h。酶解后先過200目篩，將濾液在4 500 r/min條件下離心10 min，再進行抽濾，得到澄清的魚蛋白水解液并測定其鹽度。再補加NaCl，使魚蛋白水解液的鹽度達到25%，然后經121℃，滅菌20 min。

1.3.4 耐鹽乳酸菌的發(fā)酵

將從魚露里篩選的耐鹽乳酸菌先用含10%NaCl的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，再轉接至含20%NaCl的MRS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至變渾濁后進行平板計數，再分別接種到已滅菌的魚肉水解液樣品中，使接種后的魚肉水解液中乳酸菌總數大約為107CFU/mL，以不接種任何菌種的魚肉水解液為空白對照，30℃，有氧條件下培養(yǎng)60 d，分別在培養(yǎng)0、5 d、15 d、30 d、45 d、60 d取樣，每組3個平行。定期取樣，用快速濾紙過濾后得待測液，進行后續(xù)各項指標的測定。發(fā)酵過程中定期無菌取樣測定鹽度，補加蒸發(fā)的水分以保持鹽度恒定。

1.3.5 耐鹽乳酸菌發(fā)酵性能研究

（1）pH值及總酸的測定

pH值測定采用數字式pH計測定；總酸測定參照國標GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[14]中的方法進行。

（2）細菌數量的測定

采用平板計數法，利用含有10%NaCl的MRS培養(yǎng)基進行平板計數，計數結果單位為CFU/mL。

（3）鹽度的測定

鹽度的測定參照國標GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測定》[15]中的方法進行。

（4）氨基酸態(tài)氮的測定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）的測定參照國標GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[14]中的方法進行。

（5）揮發(fā)性鹽基氮測定

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）測定參照國標GB5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[16]中的微量擴散法。

（6）總可溶性氮的測定

總可溶性氮（total soluble nitrogen，TSN）的測定參照國標GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》[17]中的凱氏定氮法。

（7）組胺含量的測定

樣品衍生化處理：移取5mL發(fā)酵液于50mL的離心管中，加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，均質1 min，于3 000 r/min條件下離心10 min，轉移上清液至容量瓶中，將沉淀重復提取一次。取1.0 mL提取液于5.0 mL棕色容量瓶中，依次加入2mol/L氫氧化鈉溶液100μL、飽和碳酸氫鈉溶液300μL和10 g/L丹酰氯溶液2 mL后，在40℃的條件下避光反應45 min。反應完畢后，加入100 μL氫氧化銨，靜置30 min，用乙腈定容到5.0 mL，振蕩混勻，取適量過0.22 μm濾膜后待測定。

組胺含量的測定采用高效液相色譜（high performanceiquid chromatography，HPLC）法[18]，其色譜條件為：DIKMA Spursil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫 35 ℃；流速1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長為254 nm。流動相為水（A）和乙腈（B），采用二元高壓梯度洗脫，梯度洗脫條件：0～10 min，65%B→71%B；10～25 min，71%B→74%B；25～50 min，74%B→81%B。根據保留時間定性，采用內標法定量。

（8）呈味核苷酸的測定

參照國標GB 5413.40—2016[19]《嬰幼兒食品和乳品中核苷酸的測定》中的HPLC法進行測定。其色譜條件為：色譜柱為Platisil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流速1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長254 nm；流動相為磷酸鹽緩沖液（1.20 mmol/L四丁基硫酸氫銨，0.01 mol/L磷酸二氫鉀）∶甲醇=1 000∶40（V/V），用磷酸調pH值至3.2，等梯度洗脫。根據保留時間定性，采用內標法定量。

1.3.6 感官評定方法和標準

采用定量描述分析法（quantitative description analysis method，QDA）進行感官評定。感官評價小組由10人組成5男5女），10人經總時間≥2 h的培訓后，分別對魚露的色澤、透明度、氣味（酯香味、醬香味、鹵肉味、魚腥味、腐臭味）和滋味（澀味、酸味、鮮味、甜味、咸味）進行感官評價，按1～7分進行評分，“1”代表完全沒有所指的味道，“7”代表所指味道非常強烈。

1.3.7 數據處理

測定和分析結果采用SPSS 20.0和Excel 2007進行數據處理，結果采取均值±標準差形式，P＜0.05認為具有顯著差異。采用MEGA7軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選結果

通過篩選，發(fā)現5株菌在篩選平板上產生明顯的溶鈣圈，分別命名為菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F。

2.2 菌種鑒定結果

菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)結果見圖1。由圖1可知，單菌落后經革蘭氏染色，均呈革蘭氏陽性，細胞均呈球狀，四聯或成對。

圖1 菌落形態(tài)(A)及細胞形態(tài)(B)Fig.1 Colony morphology(A)and cell morphology(B)

將這5株菌測序獲得的16S rDNA序列在EzBicloud網站上比對，找到與其同源性較高的模式菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。由圖2可知，菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E與Tetragenococcus halophilus的進化距離最接近，菌株JL-F與Staphylococcus epidermidis在同一分支上，同時結合形態(tài)學鑒定結果，可以鑒定菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E均為嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）；菌株JL-F為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）。

圖2 5株耐鹽菌基于16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of five salt-tolerant bacteria

2.3 耐鹽乳酸菌的發(fā)酵性能研究

2.3.1 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中pH值及總酸的變化

耐鹽乳酸菌具有產乳酸的能力，從而使得魚肉水解液的pH值發(fā)生改變。因此測定了魚肉水解液中pH值，結果見圖3。

圖3 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中pH變化Fig.3 Changes of pH value during fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，魚肉水解液中的pH值先下降后趨于平緩。發(fā)酵15 d后菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F的pH值分別穩(wěn)定在4.35、4.90、4.33、4.60、5.40。經SPSS分析，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵得到的魚肉水解液的pH值在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。對照組的pH值基本保持穩(wěn)定（pH 5.65）。

魚肉水解液中總酸的測定結果見圖4。由圖4可知，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中總酸的含量呈現逐漸上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，總酸含量最高可達27.28mmol/100mL，而對照組的總酸一直穩(wěn)定在8.00 mmol/100 mL。說明耐鹽乳酸菌的代謝活動使得發(fā)酵液中的總酸含量增加。經SPSS分析，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解液的總酸值不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

圖4 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中總酸含量變化Fig.4 Changes of total acid contents during fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

2.3.2 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中菌落數的變化

魚肉水解液中耐鹽乳酸菌數量的測定結果見圖5。由圖5可知，發(fā)酵過程中，對照組中細菌數量始終為零，而5株耐鹽乳酸菌的數量均呈現先上升后逐漸下降的趨勢。這與UDOMSIL N等[20]將嗜鹽四聯球菌接種至魚露中，提升其產品風味的研究中測得的細菌數量變化趨勢一致。發(fā)酵后期，細菌數量急劇下降。分析原因可能是：一方面因為魚肉水解液中的營養(yǎng)物質不斷地被消耗，導致營養(yǎng)匱乏；另一方面菌體本身生長代謝過程中產生的某些次級代謝產物不利于其生長。經SPSS分析，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解的菌落數在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

圖5 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中菌落總數的變化Fig.5 Changes of the total number of bacterial colonies during the fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

2.3.3 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中AAN、TVBN及TSN的變化

魚肉水解液中接種不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵后AAN、TVBN、及TSN變化趨勢分別見圖6。

圖6 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵過程中ANN(A)、TVBN(B)及TSN(C)含量變化Fig.6 Changes of ANN(A),TVBN(B)and TSN(C)contents during the fermentation of fish hydrolysates inoculated with different strains

由圖6A可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中AAN的含量呈現先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，而對照組的AAN含量在0.20 g/100 mL上下波動。不同菌株發(fā)酵液中AAN的含量呈現的趨勢基本一致。經SPSS分析，不同菌株發(fā)酵的魚肉蛋白水解的AAN含量在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖6B可知，隨著發(fā)酵時間的延長魚肉水解液中揮發(fā)性鹽基氮的含量逐漸上升，且接種表皮葡萄球菌JL-F的魚肉水解液發(fā)酵至60d時，TVBN含量升至155.31mg/100mL。而對照組雖未接種菌種，但其TVBN含量也呈現逐漸上升的趨勢，分析原因可能是魚肉水解液中發(fā)生化學反應導致。經SPSS分析，不同菌株發(fā)酵的魚肉蛋白水解的TVBN值在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。

由圖6C可知，接種不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中TSN含量呈現逐漸上升的趨勢。而對照組的TSN含量基本穩(wěn)定在11.3 g/100 mL。經SPSS分析，嗜鹽四聯球菌JL-B、JL-C、JL-D、JL-E發(fā)酵的魚肉蛋白水解的TSN值在不同時間點均無顯著差異（P＞0.05），但4株嗜鹽四聯球菌與表皮葡萄球菌JL-F均存在顯著差異（P＜0.05）。

2.3.4 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液中呈味核苷酸檢測結果

核苷酸對魚貝類的風味有一定的影響，通常認為5′-肌苷酸二鈉（inosine-5'-monophosphate，IMP）和5′-鳥苷酸二鈉（guanosine-5'-monophosphate，GMP）是主要的呈味核苷酸。故本研究測定了發(fā)酵60 d的魚肉水解液中核苷酸含量，其液相色譜圖見圖7。由圖7可知，不同耐鹽細菌發(fā)酵的魚肉水解液中無IMP和GMP，分析原因可能是發(fā)酵液提供的酸性環(huán)境，使得IMP和GMP分解為肌酐和黃嘌呤[21]。

圖7 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵60 d時呈味核苷酸含量檢測高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of flavor nucleotides contents in hydrolysates inoculated with different strains after 60 d fermentation

2.3.5 不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中組胺檢測結果

組胺是水產品中最主要的生物胺[22]，主要由微生物的氨基酸脫羧酶作用于氨基酸脫羧生成[23]，危及人體健康。故該研究對魚肉水解液中組胺含量進行了測定，結果見圖8。由圖8可知，不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉水解液中未檢測到組胺。而UDOMSIL N等[20]發(fā)現接種嗜鹽四聯球菌能降低魚肉水解液中的組胺含量，這與本研究的測定結果不一致。分析原因可能是本研究采用的無菌的魚肉水解液作為發(fā)酵原料，發(fā)酵過程中僅受接種菌株的影響。而UDOMSIL N等研究中使用的是未滅菌的魚肉水解液，其中涉及的微生物不只是嗜鹽四聯球菌，組胺的生成可能是多種微生物共同作用的效果。由此推測，本研究中篩得的5株耐鹽乳酸菌可能不產生組胺。

圖8 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵60天時組胺含量檢測液相色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of histamine contents in fish hydrolysates inoculated with different strains after 60 d fermentation

2.3.6 不同菌株發(fā)酵魚肉水解液感官評價結果

對不同菌株發(fā)酵的魚肉水解液進行感官評價，結果見圖9。由圖9可知，接種嗜鹽四聯球菌JL-B發(fā)酵的魚肉水解液在其透明度、酯香、醬香、鹵肉味、鮮味的得分分別為5.5、5.5、5.3、3.6、3.8，均高于其他菌株發(fā)酵的魚肉水解液。接種嗜鹽四聯球菌JL-B的魚肉水解液為淺棕色的透亮液體，有濃郁的酯香及醬香。該魚肉水解液的鮮味、鹵肉味可接受程度更高，但是甜味并非是最突出的。綜合各種感官評價的指標發(fā)現，接種嗜鹽四聯球菌JL-B的魚肉水解液被感官評價參與者的接受度最高。

圖9 接種不同菌株的魚肉水解液發(fā)酵60 d時感官評定結果Fig.9 Sensory evaluation results of fish hydrolysate inoculated with different strains after 60 d fermentation

3 結論

本研究從魚露中篩選獲得5株耐鹽乳酸菌，編號分別為JL-B、JL-C、JL-D、JL-E、JL-F。通過形態(tài)學和分子生物學鑒定，鑒定菌株JL-B、JL-C、JL-D、JL-E均為嗜鹽四聯球菌，菌株JL-F為表皮葡萄球菌。然后對5株耐鹽乳酸菌的發(fā)酵特性進行了研究。結果表明：不同耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解的pH值、總酸度及菌落數在不同時間點均存在顯著差異（P＜0.05）。5株耐鹽乳酸菌發(fā)酵的魚肉蛋白水解液的pH值、AAN和TVBN存在顯著差異（P＜0.05），而TSN的含量并無顯著差異（P＞0.05）。不同菌株發(fā)酵的魚肉水解液中均未檢測到呈味的IMP和GMP且未檢測到組胺。經感官評價，4株嗜鹽四聯球菌存在差異，接種嗜鹽四聯球菌JL-B的魚肉水解液在風味和氣味上被消費者接受的程度更高。

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