GIS1基因對釀酒酵母耐受性的研究

付肖蒙，肖冬光，郝愛麗，董勝勝，李 瀟，董 健*

（天津科技大學 生物工程學院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

化石能源的日益枯竭以及人們環(huán)保意識的增強，燃料乙醇生產越來越受到人們的重視。目前，生物發(fā)酵法被應用于全球各地的各個行業(yè)的乙醇生產中。燃料乙醇的生產仍然主要通過釀酒酵母發(fā)酵淀粉或糖質原料來實現(xiàn)。它們均為農副產品，如糖蜜、谷類作物（玉米、小麥、大米等），并以此為主要的發(fā)酵原料，經(jīng)過蒸煮、糖化，使其中的多糖或者淀粉等大分子水解成為葡萄糖、果糖等單糖小分子。再將這些單糖小分子通過酵母本身的生物代謝發(fā)酵，從而使這些小分子轉化生成目的產物，這是一種傳統(tǒng)并可長期有效利用可再生資源的生產方法[1]。生物發(fā)酵法生產乙醇不會產生工業(yè)行業(yè)中的“三廢”，具有長期可持續(xù)性，符合國家所倡導的走可持續(xù)發(fā)展道路的發(fā)展觀[2]。隨著濃醪發(fā)酵工藝的廣泛應用，給釀酒酵母的耐受性提出了較高的要求，如高滲透壓耐受性、高乙醇耐受性[3-4]、高溫耐受性[5]及高乙酸耐受性[6]等。因此，對脅迫環(huán)境有抗性的酵母菌株的開發(fā)和應用具有很重要的意義。同時，對具有較強耐受性釀酒酵母的分離篩選越來越受到關注，逐漸成為研究重點。SANCHEZY等[7]過量表達基因HSP104，提高了酵母細胞的高溫耐受性。VERSELE M等[8]將酵母的HSP104基因導入到hsp101基因缺陷型熱敏感的刀豆中，使刀豆細胞獲得了正常的溫度耐受性。WOLFGANGR等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Msn4p在細胞處于高濃度乙醇脅迫環(huán)境中起著調節(jié)作用。SWAN T M等[10-11]對酵母細胞在加鹽培養(yǎng)基中的生長情況分別進行了研究，發(fā)現(xiàn)海藻糖含量與細胞對外界不利環(huán)境的耐受性有著密切關系。目前，研究酵母細胞的耐受性問題主要從熱休克蛋白[12]、糖蛋白[13]、海藻糖含量[14]、細胞能量代謝相關基因[15]、細胞膜成分的合成基因[16]、細胞內氨基酸的合成和轉運[8]等方面。除了能夠修復高溫損傷的蛋白質，熱休克蛋白還能修復其他原因損傷的蛋白質。海藻糖的含量不僅與乙醇脅迫有關，還與滲透壓脅迫、氧化脅迫有關。NAKAGAWA Y等[17]獲得一株對乙醇、鹽、有機溶劑、高溫、高糖、H2O2等都具有一定耐受能力的突變株MLT1-1。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母細胞，釀酒酵母的時序壽命與其壓力抗性，尤其是熱激抗性正相關，而與Ras/cAMP/PKA信號通路的活性負相關，即蛋白激酶A的活性可影響細胞的生長和耐熱性能，活性高的細胞生長性能好，而活性低的細胞對熱脅迫耐受性好。Gis1轉錄因子是一種鋅指蛋白，是應答損傷的、編碼光解酶的PHR1基因的抑制子，能夠作為抑制rim15Δ突變株在營養(yǎng)缺乏條件下對SSA3轉錄抑制缺陷的抑制子被發(fā)現(xiàn)的[18]。Gis1在Rim15的下游，它通過作用于基因啟動子里的PDS（post-diauxicshift）元件激活基因轉錄，如SSA3基因。缺失Gis1會使突變體細胞缺陷性響應影響限制誘導的激活[19]。過量表達Gis1則會抑制細胞生長，Gis1水平的降低能減弱對蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）的依賴性，從而增加細胞的耐受性，這表明Gis1激活一個或多個抑制細胞增殖的基因的表達。PDS的核心與逆境應答元件STRE（stress-responsiveelement）的共有序列十分相似，因此推測Gis1和Msn2/4根據(jù)啟動子的特征可能有部分重疊功能，所以在Msn2/4不存在時，Gis1可能作用于STRE位點[20]。工業(yè)應用中對酵母的耐受性有很高的要求，人們期望得到耐高溫、耐高滲透壓、耐高濃度酒精、耐高乙酸等高耐受性的菌株。但是在發(fā)酵過程中，脅迫環(huán)境如高溫、高滲透壓、營養(yǎng)饑餓、高濃度酒精毒性等不可避免，故而提高酵母菌種的耐受性，可以提高菌種的發(fā)酵性能，降低發(fā)酵過程中能量消耗，從而提高工廠生產效益和經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AY12、AY 12a以及AY12aΔU：天津科技大學天津市工業(yè)微生物重點實驗室；玉米粉：天津市濱海新區(qū)人人樂購物超市。

1.1.2 化學試劑

高保真PrimeStar DNA 聚合酶（5 U/μL）、高保真LA DNA聚合酶（5 U/μL），rTaqDNA 聚合酶（5 U/μL）：大連TaKaRa公司；無氨基酵母氮源（yeast nitrogen base，YNB）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒：北京Solarbio科技有限公司；5-氟乳清酸（5-fluoroorotic acid，5-FOA）：上海源葉生物科技有限公司；Ura Dropout powder：北京泛基諾科技有限公司；尿嘧啶：上海生物工程有限公司；α-淀粉酶（30U/g）、糖化酶（180 U/g）：諾維信（中國）投資有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

釀酒酵母（S.cerevisiae）單倍體和二倍體菌株AY12aΔU、AY12a和AY12均采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，pH自然，115℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需再添加2%的瓊脂粉；轉化子用URA3基因營養(yǎng)缺陷型（synthetic dropout，SD）培養(yǎng)基：葡萄糖2%，YNB 0.67%，Ura Dropout powder 0.13%，100 mg/L尿嘧啶，115℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需再添加2%的瓊脂粉。

1.1.4 引物

本實驗所有用到的引物序列如表1所示。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in the study

1.2 儀器與設備

APCR-E3112聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）儀：德國Biometra公司；7890型氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Kodak Gel Logic 212全自動凝膠成像儀：美國Syn Gene公司；IS-RDS3型恒溫搖床：上海智城儀器制品有限公司；AB204-S型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）公司；LDZM-60KCS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HS-1300-V型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；G560E旋渦振蕩儀：美國Scientific Industries公司。

1.3 方法

1.3.1 脫氧核糖核酸（DNA）提取和純化

使用酵母DNA基因組提取試劑盒，參照產品說明書進行酵母基因組的提取，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA片段純化回收試劑盒，參照產品說明書進行DNA片段的純化回收[21]。

1.3.2 聚合酶鏈反應擴增

PCR反應條件為：95 ℃、5 min；94 ℃、45 s；54 ℃、2 min；72℃、2min；30個循環(huán)；72℃保溫10min。PCR擴增產物4℃保存。取PCR擴增產物2μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。

1.3.3 酵母高效醋酸鋰轉化法

（1）挑取釀酒酵母菌泥接于5mLYEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。

（2）取2.5×108個細胞于50 mL YEPD液體培養(yǎng)基中（約5×106個細胞/mL），30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至2×107個/mL，約培養(yǎng)4～6 h。

（3）大離心管收集菌體，將離心管置于冰袋中，4℃條件下5 000 r/min離心5 min。

（4）25 mL無菌去離子水洗滌兩次，每次將菌體搖勻后離心，棄上清液，收集菌體。

（5）將菌體懸浮于1 mL 0.1 mol/L的醋酸鋰中，混勻后轉移到1.5mL離心管中，在4℃條件下5000r/min離心5min，去上清。

（6）將細胞重新懸浮于0.5 mL 0.1 mol/L的醋酸鋰中，50 μL/管進行分裝。取50 μL懸浮液，離心，去上清。

（7）1mL鮭魚精單鏈DNA（singlestrandedDNA，ssDNA）10 mg/mL）樣品煮沸5 min，冰浴2 min。

（8）轉化體系（360 μL）：將上述離心后的50 μL菌體中依次加入240 μL體積分數(shù)為50%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），36 μL的1 mol/L醋酸鋰，50 μL 的2 mg/mL的ssDNA以及34 μL的轉化片段。

（9）將上述混合物用旋渦振蕩儀輕柔振蕩，混勻30 s，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置30 min。

（10）上述懸液于42℃水浴鍋中熱擊40 min。

（11）5000r/min離心2min，棄上清液，加入1mL新鮮的液體YEPD重懸菌體，并將重懸后的菌體放入30℃、100r/min搖床回復培養(yǎng)4 h，12 000 r/min離心1 min，適量dd H2O重懸菌體，取100 μL重懸菌液涂布于SD篩選平板上于30℃放置2 d。

1.3.4 玉米原料高溫濃醪發(fā)酵工藝

（1）玉米水解液的制備

稱取1 500 g的玉米粉，加入4 500 mL 65～70℃的自來水，靜置放置20 min，使玉米顆粒充分吸水膨脹。加入液化酶（α-淀粉酶）0.9 mL，于85～90℃條件下水浴液化1.5 h，前30 min不斷攪拌，使得玉米粉充分溶解。轉入60℃水浴鍋中，并加入3 mL糖化酶，在55～60℃下糖化20 h。糖化完成后，四層濾布過濾糖化液，將得到的澄清濾液經(jīng)高壓蒸汽滅菌（105℃滅菌20 min），即為玉米水解液，pH自然。

（2）種子培養(yǎng)基的配制

一級種子培養(yǎng)基：8°Bx的玉米水解液，添加0.5%的酵母浸粉，每支試管分裝5 mL，105℃滅菌20 min，待液體冷卻，接種酵母單菌落，30℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。

二級種子培養(yǎng)基：12°Bx的玉米水解液，添加0.5%的酵母浸粉，每個錐形瓶分裝45 mL，105℃滅菌20 min，將一級種子液全部倒入100 mL錐形瓶，30℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h。

（3）同步糖化高溫濃醪發(fā)酵工藝

稱取100g玉米粉洗凈、干燥且稱質量的500 mL三角瓶中，加入200 g 60～70℃的自來水和30 μL 30 U/g原料的淀粉酶，調節(jié)pH至5.5～5.8，攪拌均勻，沸水浴液化，料液溫度達到90℃開始計時液化90min，液化過程中不斷攪拌，液化結果以碘試無藍色且呈紅棕色為準。液化完成后冷卻至38℃左右，調節(jié)pH至4.2～4.4，加入90 μL 180 U/g原料的糖化酶，0.36 g尿素，15 mL二級種子液，攪拌均勻，并用35℃左右的自來水補足液化過程中損失的水，普通封口膜，聚乙烯（polyethylene，PE）手套將發(fā)酵瓶瓶口密封，30℃、160 r/min條件下培養(yǎng)12 h，后轉入38℃、160 r/min條件下進行搖床發(fā)酵。在此過程中，每隔12 h稱質量一次，兩次差值小于1 g即可蒸酒。待發(fā)酵48 h，測48 h細胞存活率，且此時將發(fā)酵溫度改為30℃。

1.3.5 釀酒酵母細胞生長曲線的測定

酵母正常生長溫度為30℃，在乙醇的發(fā)酵過程中，當發(fā)酵醪液的溫度＞38℃時，就必須使用冷卻水進行降溫，否則就會對釀酒酵母的活性產生抑制，影響乙醇的產率以及還原糖的利用率，因此分別測定出發(fā)菌和改造菌在30℃和40℃條件下的生長曲線能夠更清楚的看出改造菌下發(fā)酵過程中的生長性能從而看出其耐高溫能力[22]。

本實驗采用全自動生長曲線測定儀測定吸光度值（OD600nm值），操作步驟如下：

（1）菌種活化：挑取斜面上一環(huán)菌泥接至5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。

（2）生長曲線的測定：吸取上述培養(yǎng)液40μL接入360μL液體YEPD培養(yǎng)基的100孔板中，將100孔板置于設定的溫度下培養(yǎng)，以未接種的YEPD液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔0.5 h于波長600 nm處測定吸光度值，以培養(yǎng)時間（h）為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制菌株生長曲線圖。

1.3.6 釀酒酵母細胞耐受性的測定

熱激耐受性測定：從斜面挑取釀酒酵母AY12a和AY12agis1單菌落，于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。測OD600nm值，取適量菌液轉接入5 mL新鮮YEPD液體培養(yǎng)基中，使其初始OD600nm值為0.15。將上述細胞培養(yǎng)4～6 h至生長對數(shù)期。測量OD600nm值，調整所有細胞OD600nm值為1，以保證所有細胞初始菌體濃度一致。分別移取100μL的菌液于1.5 mL離心管中，實驗組作55℃水浴4 min熱擊處理，對照組不做任何處理。

將實驗組和對照組分別用無菌水稀釋相同的濃度梯度，按照濃度遞減的順序，每個稀釋度取2 μL的菌液整齊的滴于YEPD固體培養(yǎng)基平板上，超凈工作臺晾干后，封口膜封好倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體的生長，比較釀酒酵母AY12和AY12a-gis1的55℃熱激4 min條件下的耐熱激情況。

NaCl、乙醇和乙酸耐受性測定：每個稀釋度分別移取2 μL對照組和實驗組菌液整齊的滴于分別含有6%NaCl、15%（V/V）的乙醇及5%（V/V）的乙酸的YEPD培養(yǎng)基平板上[23]，超凈臺晾干后，封口膜封好倒置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d，觀察菌體生長，比較不同菌株對NaCl、乙醇及乙酸的耐受性情況。

1.3.7 高溫濃醪發(fā)酵的參數(shù)測定

利用酒精比重計對酒精度進行測定；使用斐林試劑法進行還原糖含量測定；采用血球計數(shù)儀進行活細胞數(shù)的測定，細胞存活率計算公式如下：

式中：X為釀酒酵母發(fā)酵48 h后細胞存活率，%；C1為血球計數(shù)板中經(jīng)過次甲基藍染色劑染色后著色的細胞數(shù)，個；C2為血球計數(shù)板中全部的細胞數(shù)，個。

2 結果與分析

2.1 構建AY12a-gis1酵母突變株

以野生型釀酒酵母工業(yè)菌株AY12a為親本菌株，基因URA3為篩選標記，在GIS1基因的N端加入強啟動子PGK1p，以實現(xiàn)GIS1基因的過表達。同時設計四對引物，用于PCR擴增獲得帶有同源臂的四個片段GIS1p、URA3、PGK1p和GIS1。將四個擴增片段進行PCR純化回收，利用醋酸鋰轉化法將純化后的片段導入到受體菌株AY12a△U完成同源序列之間的同源重組，轉化產物涂布于尿嘧啶缺乏的SD培養(yǎng)基上，生長2～3 d后得陽性轉化子，單菌落進行純化，精提基因組并以此為模板進行PCR測定。由于受體菌株AY12a△U含有突變的URA3基因，經(jīng)醋酸鋰化轉后同源重組正確的轉化子在SD培養(yǎng)基上可以生長，以此篩選正確轉化子。AY12a-gis1突變株的構建過程如圖1所示。

圖1 過表達GISI基因的流程圖Fig.1 Flow chart of geneGISIoverexpression

2.2 目的片段的擴增

按照方法1.3.1精提酵母基因組，以親本菌株AY12a為模板，利用引物對GIS1上同源臂U和GIS1上同源臂D、GIS1-URA3U和GIS1-URA3D、GIS1-PGK1pU和GIS1-PGK1pD、GIS1下同源臂U和GIS1下同源臂D進行PCR擴增帶有部分同源的四個基因片段，其片段長度大小見圖2。由圖2可知，四個基因片段分別為811 bp、864 bp、1 524 bp及1 709 bp，與預期片段大小一致。

圖2 帶有同源臂的GIS1片段擴增驗證Fig.2 Verification ofGIS1fragment amplification with homologous arm

2.3 突變株的獲得

按照方法1.3.1精提陰性對照AY12a基因組及粗提基因組驗證正確的菌株基因組，分別利用引物進行驗證。利用引物對驗證GIS1上同源臂-URA3U和驗證GIS1上同源臂-URA3D、驗證PGK1p-GIS1U和驗證PGK1P-GIS1D、驗證URA3-PGK1PU-GIS1和驗證URA3-PGK1pD-GIS1進行過表達GIS1基因菌株進行定點驗證，可以擴增出大小為1 241 bp、2 312 bp和1 433 bp的特異性片段。與預期大小一致，且陰性對照PCR后無此條帶，結果如圖3所示。由圖3可知，AY12a-gis1突變株已成功構建。

圖3 定點PCR驗證GIS1電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram ofGIS1verification using specific PCR

2.4 酵母基因突變株與親本菌株生長性能的比較

利用生長曲線測定儀對親本菌株AY12a和AY12a-gis1突變菌株在進行生長曲線的測定。挑取一環(huán)AY12a和AY12a-gis1菌泥接種于5 mL YPED液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，按照方法1.3.5對親本菌株和突變株在30℃和40℃條件下進行生長曲線的測定，結果見圖4。

由圖4可知，親本菌株和各個突變株的生長趨勢。根據(jù)各個菌株的生長速度和最終菌體濃度可以看出，在30℃的培養(yǎng)條件下菌株AY12a-gis1與親本菌株AY12a的生長速度相比，生長性能基本相一致；當生長溫度改為40℃時，AY12a-gis1突變株的菌體濃度較親本菌株AY12a有所提高，且對數(shù)期與親本相一致。

圖4 菌株在30℃(A)和40℃(B)條件下的生長曲線Fig.4 Growth curves of strains under the conditions of 30℃(A)and 40℃(B)

2.5 釀酒酵母基因突變株與親本菌株耐受性的比較

按照材料與方法中1.3.6中所描述的方法測定出發(fā)菌株AY12a以及突變菌株AY12a-gis1在55℃熱擊4 min、15%V/V）的乙醇、6%NaCl及5%（V/V）乙酸的脅迫環(huán)境下進行耐受性分析，結果如圖5所示。

圖5 菌株的耐受性Fig.5 Tolerance of strains

由圖5可知，在沒有生長壓力的YEPD平板上，出發(fā)菌株AY12a和突變株AY12a-gis1的生長情況基本上是一致的，可見出發(fā)菌株以及突變菌株的初始菌體濃度基本上保持是一致的。在55℃熱擊4 min處理造成的環(huán)境壓力下，出發(fā)菌株和突變菌株的生長都受到了很大程度的抑制。但相比出發(fā)菌株，在相同的稀釋倍數(shù)下，菌株AY12a-gis1菌落數(shù)較多，說明其熱擊抗性優(yōu)于出發(fā)菌株AY12a，在15%（V/V）的乙醇和6%的NaCl條件下，相同的稀釋倍數(shù)下，AY12agis1突變株的菌落數(shù)均低于原菌，說明菌株AY12a-gis1的耐乙醇和耐鹽能力并無提高；在5%（V/V）乙酸造成的環(huán)境壓力下，相比出發(fā)菌株AY12a，突變菌株AY12a-gis1在相同的稀釋倍數(shù)下，菌落個數(shù)與原菌AY12a沒有差別，說明5%的乙酸對這些突變株的生長沒有受脅迫因素的影響。

2.6 釀酒酵母基因突變株與親本菌株的玉米原料高溫濃醪酒精發(fā)酵

按照方法1.3.4將改造后的突變株AY12a-gis1和出發(fā)菌株AY12a進行玉米高溫濃醪發(fā)酵。待發(fā)酵進行48 h，將發(fā)酵液搖勻，取樣液，用3層紗布濾去玉米渣，用無菌水稀釋至合適倍數(shù)，按照方法1.3.7檢測48 h細胞存活率，待發(fā)酵完成后測定發(fā)酵液中乙醇含量和發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮俊y定結果見表2。

表2 突變菌株的發(fā)酵性能和細胞存活率Table 2 Fermentation performance and cell survival rate of mutant strains

由表2可知，在38℃濃醪發(fā)酵中，突變株AY12a-gis1與出發(fā)菌株AY12a相比，菌株AY12a-gis1的酒度提高了3.79%，殘?zhí)锹杂邢陆担野l(fā)酵時間與親本菌株相一致。說明菌株AY12a-gis1耐高溫性能使乙醇產率明顯提高，這與細胞生長曲線的測定結果是一致的，且與耐受性實驗也大致相符。酵母細胞發(fā)酵時間的延長，常伴隨著細胞耐受性的增加，比如高乙醇、高溫、高滲透壓等。

3 結論

本研究通過PCR擴增出GIS1上同源臂U和GIS1上同源臂D、GIS1-URA3U和GIS1-URA3D、GIS1-PGK1pU和GIS1-PGK1pD、GIS1下同源臂U和GIS1下同源臂D片段。同時以URA3缺陷型菌株AY12aΔU為出發(fā)菌株，以正常URA3作為篩選標記，采用醋酸鋰轉化法通過在GIS1基因的N端加入強啟動子PGK1p，以實現(xiàn)GIS1基因的過表達進而對酵母細胞的生長和耐受性進行調節(jié)，從而構建出一株耐高溫的釀酒酵母菌株。結果表明，相同的稀釋倍數(shù)下可以看出55℃熱擊4 min之后菌株AY12a-gis1的生長能力明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，在含有5%（V/V）乙酸的平板上改造菌和出發(fā)菌耐受性相差不大，同時通過38℃濃醪發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)菌株AY12a-gis1的酒精度提高了3.79%，殘?zhí)锹杂邢陆担野l(fā)酵時間與親本菌株相一致。因此菌株AY12a-gis1可以很好的用于發(fā)酵工業(yè)，同時對于工業(yè)發(fā)酵生產也有重要的應用價值。

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