新一代精準(zhǔn)基因編輯工具CRISPR/Cas9的技術(shù)優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用局限

吳言 郝雅蕎，2 韋璇，2 沈琦 柳葉飛 王升厚 趙洪新

（1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2. 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034；3. 沈陽(yáng)師范大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110034）

近年來(lái)，有關(guān)位點(diǎn)特異性核酸酶（Site-specific nuclease，SSN）的基礎(chǔ)理論研究取得了突破性進(jìn)展，使精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，也取得了令人矚目的成就。位點(diǎn)特異性核酸酶在生物體的基因編輯中提供了十分精準(zhǔn)有效的DNA切割方法［1］，其中，鋅指核酸酶（Zine finger endonuclease，ZFN）以及類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs）已被廣泛應(yīng)用于基因工程技術(shù)中。這兩種核酸酶的切割原理相同，均是將DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶FokI融合完成雙鏈特異性切割，但兩種酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域較為復(fù)雜，操作上技術(shù)難度相對(duì)大，耗時(shí)長(zhǎng)且容易脫靶［2-4］，成為制約其發(fā)展的障礙。2013年，Cathomen［5］基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成人工核酸內(nèi)切酶 CRISPR Cas 9，在真核和原核生物中進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯嘗試，獲得巨大成功。這種全新的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)以制作簡(jiǎn)單、成本低、作用高效［5］等優(yōu)勢(shì)迅速發(fā)展，并成功應(yīng)用于各種原核生物和真核生物中，包括大腸桿菌［6］、釀酒酵母［7］、鏈霉菌屬［8］、高等植物［9］、家蠶［10］、果蠅［11］和人類(lèi)細(xì)胞［12-14］等。本文從 CRISPR/Cas的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及影響CRISPR/Cas打靶效率的因素等方面進(jìn)行總結(jié)，旨為深刻理解其工作原理和在精準(zhǔn)基因編輯中應(yīng)用提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史

1987年，日本科學(xué)家在大腸桿菌K12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列［15］，但由于其功能無(wú)法確定，并未引起科學(xué)家的注意。1995年，西班牙科學(xué)家Mojica等［16］在地中海極嗜鹽菌（Haloferax mediaterranei）和沃爾卡尼極嗜鹽菌（Haloferax volcanii）中第二次發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。Mojica敏感地意識(shí)到在親緣關(guān)系如此遠(yuǎn)的微生物中存在如此相似的結(jié)構(gòu)，可能有著尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞功能，引起了許多研究人員的極大關(guān)注。2002年，Coffey等和Jansen等［17-18］把串聯(lián)重復(fù)序列正式命名為成簇間隔規(guī)律短回文重復(fù)序列（Clustered regularly short palindromic repeats，CRISPR），但其生物學(xué)功能仍未闡明。2005年，法國(guó)的Bolotin和Vergnaud、西班牙的Mojica三位科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的3個(gè)實(shí)驗(yàn)室［19-21］幾乎同時(shí)報(bào)道CRISPR中的間隔序列（Spacer）與侵染細(xì)菌的病毒或噬菌體具有很高的同源性，并推測(cè)CRISPR系統(tǒng)可能與細(xì)菌的免疫防御機(jī)制有關(guān)。2007年，Barrangou 等［22］首次發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）能夠通過(guò)CRISPR/Cas系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵，證實(shí)了CRISPR/Cas可以獲得性的提供細(xì)菌對(duì)抗噬菌體的能力。2012年，Sternberg等［23］發(fā)現(xiàn)了II型CRISPR系統(tǒng)，該系統(tǒng)中只需要一個(gè)160 kD的Cas9蛋白，同時(shí)利用RNA就可以完成識(shí)別和切割靶向DNA序列。這一防御系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了科研工作者對(duì)于其在基因編輯作用中的研究熱情，利用和優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的探索研究越來(lái)越多，科研成果也層出不窮，精準(zhǔn)編輯功能在細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物中都得到了認(rèn)證，是新一代基因編輯技術(shù)。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展及對(duì)越來(lái)越多微生物基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，人們發(fā)現(xiàn)在已知物種中有90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌的基因組中含有CRISPR位點(diǎn)，而且絕大多數(shù)的細(xì)菌和古細(xì)菌中至少含有一個(gè)CRISPR基因座，極少數(shù)的古細(xì)菌中含有上百個(gè)CRISPR基因座，說(shuō)明了CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌免疫防御機(jī)制是十分重要的［24］。CRISPR/Cas基因座由3個(gè)部分組成，5'端為tracrRNA基因，中間是Cas家族蛋白，3'端為CRISPR基因座，主要由一個(gè)前導(dǎo)序列、23-50 bp的重復(fù)序列和間隔序列串聯(lián)組成，間隔序列由17-84 bp組成，平均長(zhǎng)度約為36 bp。

Cas蛋白來(lái)自于細(xì)菌具有切割DNA的活性蛋白，除了探究已知的細(xì)菌Cas蛋白差異之外，環(huán)境中存在著很多不為人知或不可培養(yǎng)的微生物種類(lèi)，研究人員從土壤，地下水，酸性礦泉水等富含微生物的環(huán)境中取材，將這些微生物的宏基因組信息與CRISPR和Cas1序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了兩類(lèi)新型的CRISPR-Cas系統(tǒng)，將其命名為CRISPR-CasX和CRISPR-CasY，其中CasX蛋白約有980個(gè)氨基酸，CasX蛋白約有1 200個(gè)氨基酸［25］?？梢?jiàn)CRISPRCas系統(tǒng)在微生物領(lǐng)域存在的普遍性，具有巨大的基因編輯潛能。

CRISPR-Cas系統(tǒng)中Cas基因進(jìn)化速度最快，根據(jù)單亞基和多亞基的crRNA效應(yīng)復(fù)合物定義可以將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類(lèi)：ClassI和ClassII。ClassI包 括 3個(gè) 亞 型 ：TypeI、TypeIII和 TypeIV，ClassII包括兩個(gè)亞型：TypeII和 TypeV［26］。研究表明，ClassII效應(yīng)蛋白Cpf1是一類(lèi)新型的CRISPR-Cas DNA核酸內(nèi)切酶，Cpf1只包含RuvC結(jié)合結(jié)構(gòu)域但不包含HNH結(jié)合結(jié)構(gòu)域［27］。Cpf1可以介導(dǎo)基因組編輯的翻譯后調(diào)節(jié)，Cas9和Cpf1的gRNA序列有明顯差異，研究人員設(shè)計(jì)同時(shí)帶有Cpf1的5'-支架序列和Cas9的3'-端序列融合版的引導(dǎo)RNA（fgRNA），fgRNA能夠通用于Cpf1和Cas9兩種類(lèi)型的核酸酶［28］。Zhang等［29］發(fā)現(xiàn)具有基因編輯潛力的 C2c2位于Leptotrichia shahii中ClassII系統(tǒng)的TypeVI上。研究表明C2c2能夠調(diào)控RNA指導(dǎo)的單鏈RNA的斷裂，深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)了C2c2是RNA指導(dǎo)的ssRNA發(fā)生斷裂效應(yīng)物。Zhang等［30］證明了來(lái)自化膿鏈球菌的Cas9酶（SpCas9）和來(lái)自金黃色葡萄球菌的Cas9核酸酶（SaCas9）具有相當(dāng)?shù)腄NA靶向精確度。這些高效Cas9蛋白的發(fā)現(xiàn)，對(duì)靶向基因表達(dá)調(diào)控提供了更加高效的基因編輯方法。

3 II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理

II型CRISPR/Cas系統(tǒng)行使功能主要分為3個(gè)階段（圖1）：即新間隔序列的獲取、CRISPR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄與加工、CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)外源DNA的降解。

第一階段新間隔序列（Spacer）的獲取可分為3個(gè)過(guò)程，當(dāng)噬菌體首次侵染攜有CRISPR系統(tǒng)的細(xì)菌中時(shí)，宿主首先掃描并識(shí)別入侵核酸的PAM序列，將臨近PAM序列的外源DNA作為候選的原間隔序列（Protospacer）。一般來(lái)說(shuō)，臨近間隔序列的幾個(gè)堿基比較保守，被稱(chēng)為（Protospacer adjacent motifs，PAM）序列，通常為NGG［31］；接著在Cas1和Cas2等蛋白質(zhì)的作用下，將入侵DNA切割成長(zhǎng)度約為48 bp的核酸片段，最后通過(guò)相關(guān)蛋白質(zhì)的作用，將其中一個(gè)核酸片段整合到前導(dǎo)序列和第一個(gè)重復(fù)序列之間，形成新的間隔序列，與這個(gè)序列同源的病毒DNA稱(chēng)為原間隔序列。

第二階段，當(dāng)相同的外源DNA再次侵入時(shí)，CRISPR基因座首先轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的前體CRISPR RNA（pre-crRNA），然后在RNaseⅢ的參與下被切割為長(zhǎng)度不等的核酸小片段，即包含一段間隔序列和部分重復(fù)序列的成熟crRNA［32］。crRNA與反轉(zhuǎn)錄激活RNA（tracrRNA）通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與Cas9蛋白形成靶向復(fù)合物crRNP，其在降解外源DNA的階段起到重要作用［13，33-34］。

第三階段是對(duì)外源DNA的干擾。復(fù)合體crRNP通過(guò)間隔序列尋找到與外源DNA互補(bǔ)的靶序列，此時(shí)Cas9起到切割雙鏈DNA的作用。在II型CRISPR系統(tǒng)中，Cas9蛋白的HNH與RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域能夠分別切割間隔序列的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂（Double strand breaks，DSBs）被降解，從而抵御了外源DNA的入侵［35］。

圖1 II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)抵御外源噬菌體的獲得性免疫機(jī)制

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

近年來(lái)，有關(guān)利用CRISPR/Cas9進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯的應(yīng)用研究發(fā)展十分迅速，已在微生物、植物、動(dòng)物及癌癥基因治療等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，與以前的基因編輯方法相比，展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生物育種中的應(yīng)用

在微生物學(xué)研究領(lǐng)域，應(yīng)用該技術(shù)在粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）［36］中將clr-2啟動(dòng)子替換為β微管蛋白啟動(dòng)子增強(qiáng)了纖維素酶的表達(dá)；Fuller等［37］在煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）中高效靶標(biāo)酮化合物合酶基因，并進(jìn)一步驗(yàn)證了組成型表達(dá)的Cas9核酸酶本身對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)和毒力沒(méi)有危害作用；Wu等［38］成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)在產(chǎn)氣腸桿菌中敲除NADH脫氫酶基因簇nuoC/D和nuoC/D/E基因，得到了雙敲除和三敲除菌株，在搖瓶水平和發(fā)酵罐水平表征菌株，結(jié)果表明在厭氧發(fā)酵罐中氫氣的產(chǎn)量是原始菌株的1.95倍，產(chǎn)氫量得到了很大的提高，為生物制氫提供了新的思路。

在植物學(xué)研究領(lǐng)域，F(xiàn)eng等［39］將玉米的標(biāo)記基因Zmzb7進(jìn)行改造優(yōu)化產(chǎn)量，結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在玉米的常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)域都可以進(jìn)行高效的基因編輯；Zhang等［40］通過(guò)CRISPR/Cas9瞬時(shí)表達(dá)獲得了初代非轉(zhuǎn)基因純合子小麥突變株；Tian等［41］成功敲除了西瓜中的八氫番茄紅素脫氫酶，結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在西瓜中的基因編輯效率達(dá)到100%。這些研究表明CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)為植物種子改良提供了新路徑。

在動(dòng)物學(xué)研究領(lǐng)域，利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功對(duì)綿羊［42］、兔子［43］等中小型哺乳類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行了基因編輯，這些研究成果為以中小型動(dòng)物模型，探究人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考。為了獲得患有蕾特氏癥的動(dòng)物模型，科學(xué)家將恒河猴（Macaca mulatta）和食蟹猴（Macaca fascicularis）的MESP2基因成功敲除，為人類(lèi)研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?4］。

4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療中的應(yīng)用

基因治療是治療病毒性疾病的熱點(diǎn)，許多癌癥都是由病毒引起，如肝癌由乙肝病毒引起，宮頸癌由人乳頭瘤病毒引起，艾滋病因感染HIV-1病毒引起等。CRISPR/Cas9來(lái)源于細(xì)菌自身的防御系統(tǒng)［45］，用該系統(tǒng)抵御并清除外來(lái)病毒感染抑制病毒生長(zhǎng)甚至可治愈病癥。Khalili等［46］發(fā)現(xiàn)Cas9/LTR-gRNA在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠在HIV-1病毒整合前明顯阻止其感染細(xì)胞。該項(xiàng)技術(shù)對(duì)于治愈病毒感染的疾病有著重要的指導(dǎo)意義。Maddalo等［47］運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠體內(nèi)敲除了EML4-ALK融合基因，對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌臨床治療提供了新的方向。Xie等［48］敲除了血紅蛋白β（HBB）基因?qū)θ祟?lèi)β-地中海貧血癥的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了探究。值得一提的是，Rong等［49］證明Cas9切口酶可以精確靶標(biāo)人體胚胎干細(xì)胞中的長(zhǎng)鏈DNA模板，其編輯效率大約在5%。這預(yù)示著該技術(shù)在不久的將來(lái)會(huì)對(duì)優(yōu)化人類(lèi)受精卵起到深遠(yuǎn)的影響。

表1例舉了部分已成功利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯的實(shí)例。從這些例子及研究者的文獻(xiàn)研究報(bào)告中可以看出，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)不僅設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、使用范圍廣，而且操作步驟簡(jiǎn)潔、實(shí)驗(yàn)周期短、驗(yàn)證過(guò)程容易，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。作為新一代的基因編輯工具，在解析基因功能，基因新性功能的探索，疾病的基因治療，生物基因改造等方面是強(qiáng)有力的方法，是探索生命的奧秘強(qiáng)有力的分子工具。

表1 部分已經(jīng)報(bào)道成功利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)基因組編輯的實(shí)例

5 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的應(yīng)用局限

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種方便快捷的基因改造方法，其通過(guò)sgRNA中的N20序列尋找并識(shí)別靶位點(diǎn)，如果需要進(jìn)行多位點(diǎn)修飾，可以設(shè)計(jì)多條sgRNA［51-53］。但是最新的研究表明sgRNA的錯(cuò)配為5個(gè)堿基時(shí)，切割仍能夠發(fā)生，這就導(dǎo)致了CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在較高的脫靶效應(yīng)［54-55］。為了降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)，研究人員對(duì)影響CRISPR/Cas9打靶效率的因素進(jìn)行了深入研究并提出了一系列解決方法。

5.1 影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的因素及解決方法

sgRNA結(jié)構(gòu)和組成能夠引起脫靶效應(yīng)［56］。研究表明增加［57］或減少［58］2-3個(gè)核苷酸的sgRNA能夠減少錯(cuò)配率從而增加靶序列的專(zhuān)一性。John等［59］創(chuàng)造了新的sgRNA設(shè)計(jì)規(guī)則并建立了人體和小鼠的全基因庫(kù)，用基因庫(kù)設(shè)計(jì)出的sgRNA能夠有效減少CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效率。

Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)打靶效率也有著重要的影響。野生型Cas9蛋白具有切割雙鏈DNA，的活性，形成雙鏈斷裂（Double-strand Breaks，DSBs）從而增加脫靶效應(yīng)的幾率。Frock等［60］將Cas9蛋白改造為Cas9 nickase（nCas9），nCas9能夠使Cas9蛋白的HNH或RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域失活而形成單鏈斷裂（Single-strand Breaks，SSBs），單鏈缺口會(huì)通過(guò)高保真的堿基切除修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)以減少脫靶效應(yīng)；Qi等［61］把 Cas9 蛋白改造為 Dead Cas9（dCas9）（圖2-A），dCas9能夠使HNH和RuvC兩個(gè)活性位點(diǎn)均失活，將dCas9與sgRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，sgRNA介導(dǎo)dCas9與DNA結(jié)合可以抑制基因的起始轉(zhuǎn)錄從而減少脫靶效應(yīng)。科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)將 dCas9 與 FokI核酸酶結(jié)合形成融合蛋白（FokI-dCas9）（圖2-B），可以增加CRISPR/Cas9的靶專(zhuān)一性，通過(guò)一對(duì)sgRNA和dCas9s識(shí)別靶序列，此時(shí)FokI二聚體切割DNA，這種方法雖然能降低脫靶效應(yīng)，但同時(shí)也會(huì)降低其打靶活力，并且對(duì)于FokI二聚體來(lái)說(shuō)N20的長(zhǎng)度對(duì)其活力有著十分重要的影響，因此限制了基因組中潛在的靶序列數(shù)量［62-63］。Slaymaker等［64］采用有針對(duì)性的深測(cè)序和無(wú)偏全基因組脫靶效應(yīng)分析評(píng)估Cas9的切割效率，證明了增強(qiáng)型化膿鏈球桿菌Cas9突變體（eSpCas9）能夠減弱脫靶效應(yīng)并且更加精確地進(jìn)行切割。

此外，PAM序列的長(zhǎng)度也是解決脫靶效應(yīng)的策略之一。金黃色釀膿葡萄球菌（Staphylococcus aureus）Cas9蛋 白（SaCas9） 識(shí) 別 的 PAM 區(qū) 為的 NNGRRT（NNGAAT、NNGAGT、NNGGAT和NNGGGT），嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）Cas9蛋 白（StCas9） 的PAM序 列 為NGGNG和NNAGAAW，腦膜炎雙球菌（Neisseria meningitidis）Cas9蛋白（NmCas9）的PAM序列為NNNNGATT，實(shí)驗(yàn)表明這些較長(zhǎng)的PAM序列能夠有效地減少脫靶效應(yīng)［65-67］。這表明更長(zhǎng)的PAM序列在全基因組中，特異性更高，潛在的脫靶位點(diǎn)少，為進(jìn)一步增強(qiáng)靶序列的專(zhuān)一性創(chuàng)造了條件。

圖2 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯機(jī)制

5.2 同源重組率對(duì)CRISPR/Cas9打靶效應(yīng)的影響

當(dāng)Cas9蛋白切割雙鏈DNA形成雙鏈斷裂后，細(xì)胞會(huì)采取非同源末端連接機(jī)制（Nonhomologous end joining，NHEJ） 或 同 源 重 組（Homologous recombination，HR）修復(fù)受損的細(xì)胞，但是非同源末端連接修復(fù)機(jī)制會(huì)引發(fā)由堿基的插入或刪除從而導(dǎo)致基因突變，同源重組修復(fù)機(jī)制能夠精確的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，增強(qiáng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性。在真核生物中研究人員發(fā)現(xiàn)KU70、KU80和DNA連接酶IV是NHEJ通路中的關(guān)鍵因子。德國(guó)MDC研究所的研究人員使用DNA連接酶IV抑制劑SCR7進(jìn)行了基因沉默，并表達(dá)了腺病毒蛋白E1B55K和E4orf6，抑制KU70和DNA連接酶IV能夠?qū)⑼炊ㄏ蛐迯?fù)（Homology directed repair，HDR）效率提高4-5倍。在人類(lèi)和小鼠細(xì)胞系中腺病毒蛋白與Cas9系統(tǒng)共表達(dá)時(shí)，HDR效率提高了8倍，大幅度抑制了NHEJ活性［68］。Whitehead研究所的研究人員在對(duì)受精卵進(jìn)行基因編輯時(shí)添加了SCR7抑制劑，這項(xiàng)研究將CRISPR/Cas的HDR率提高了19倍［69］。另一方面，研究人員還發(fā)現(xiàn)供體DNA的長(zhǎng)度也會(huì)影響同源重組率。Lin等［70］發(fā)現(xiàn)至少需要15 nt的同源臂長(zhǎng)度才能實(shí)現(xiàn)同源重組。而Rong等［71］比較了引入長(zhǎng)度為1 kb的上下游同源臂與引入單側(cè)同源臂在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中的同源重組效率，實(shí)驗(yàn)表明引入標(biāo)靶基因的雙側(cè)通同源臂后的HDR效率更高。

6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用前景

特別是近年來(lái)研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯，也取得了令人矚目的研究成果，無(wú)數(shù)成功的例子和高水平文章的發(fā)表顯示了其強(qiáng)大應(yīng)用潛力。盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍存著如打靶效率低、靶專(zhuān)一性不強(qiáng)等技術(shù)局限，但仍說(shuō)明CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍需完善，有巨大的研究空間需要探索。許多研究人員從CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成結(jié)構(gòu)分析和攻關(guān)嘗試，改良sgRNA的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)靶特異性是最直接的手段；也有研究人員致力于探索Cas9的結(jié)構(gòu)及功能，篩選和改造特異性更強(qiáng)的Cas蛋白，來(lái)解決脫靶效應(yīng)問(wèn)題，同時(shí)尋找提高同源重組率的方法對(duì)提高打靶效率也有一定的作用。相信通過(guò)研究人員的努力和嘗試，及隨著生物技術(shù)的發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用中存在的技術(shù)局限，終將被攻克，CRISPR/Cas新一代基因編輯系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)，醫(yī)學(xué)及生物等各個(gè)領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V闊的應(yīng)用前景，發(fā)揮更重要的作用。

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