熒光法測(cè)石榴中維生素C

王軍鋒，李思佳，王曉蘭

(陜西學(xué)前師范學(xué)院 化學(xué)與化工系，陜西 西安 710100)

石榴，營(yíng)養(yǎng)豐富，其籽粒味道甘美，且石榴含有豐富的維生素C。維生素C，又稱L-抗壞血酸，是人體必需營(yíng)養(yǎng)素之一，缺乏維生素C會(huì)致使壞血病，因此，必須從食物中獲取。目前測(cè)量維生素C的方法主要有高效液相色譜法[1]；紫外分光光度法；碘量法；熒光法[2]；電化學(xué)法[3]，滴定法、酶法；以及2、4-二硝基苯肼法等，除此之外Deutsch和Weeks曾經(jīng)報(bào)道過(guò)一種檢測(cè)維生素C的熒光分析法(OPDA)，并被指定為維生素C的經(jīng)典熒光分析法[4]。在該方法中，維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結(jié)合生成熒光產(chǎn)物，通過(guò)對(duì)該熒光產(chǎn)物的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素C的定量分析[5]。本文基于維生素C在草酸作溶劑不外加增敏劑的條件下經(jīng)Cu2+氧化后與鄰苯二胺反應(yīng)生成一種較強(qiáng)的熒光物質(zhì)，通過(guò)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的測(cè)定進(jìn)行維生素C的定量分析，其熒光強(qiáng)度與維生素C的濃度成正比，該方法所涉及的體系穩(wěn)定性好，據(jù)此優(yōu)化了熒光測(cè)定維生素C的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

日立F-7000熒光分光光度計(jì)；上海F-960熒光分光光度計(jì)；PHS -3C精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠； 水浴鍋。

1.1.2 試劑

抗壞血酸(分析純)；1%草酸溶液；CuSO4溶液：0.04mg/mL；維生素C標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1mg/mL，2～8℃避光保存；NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液；HAc-NaAc緩沖溶液；NaOH-KHPO4緩沖溶液；KH2PO4- Na2HPO4緩沖溶液；500g/L乙酸鈉溶液；0.2g/L鄰苯二胺溶液(臨用前配制)；30g/L硼酸-500g/L乙酸鈉溶液(臨用前配制)；偏磷酸-乙酸溶液；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 原理

維生素C自身沒(méi)有熒光，樣品中還原性抗壞血酸(維生素C)在草酸溶液后溶解后經(jīng)氧化劑(Cu2+)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，再與鄰苯二胺(OPDA)反應(yīng)產(chǎn)生具有熒光的喹喔啉，其熒光強(qiáng)度與維生素C的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。因果蔬中丙酮酸也可與鄰苯二胺反應(yīng)生成熒光化合物，加入硼酸后脫氫抗壞血酸與硼酸可構(gòu)成絡(luò)合物而不能跟鄰苯二胺反應(yīng)，而丙酮酸依然可以和鄰苯二胺反應(yīng)，所以用加入硼酸后測(cè)出的熒光強(qiáng)度為空白對(duì)照，以此除清樣品中雜質(zhì)所造成的干擾。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及過(guò)程

在25mL容量瓶中依次加入1mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶，4mL CuSO4溶液，4mL緩沖溶液，氧化五分鐘后加入3mL鄰苯二胺溶液用蒸餾水定容，搖勻。在25℃恒溫水浴中加熱30min，將溶液冷卻至室溫后，在激發(fā)波長(zhǎng)為355nm，在發(fā)射波長(zhǎng)425nm處，測(cè)定其熒光強(qiáng)度F，以不含維生素C的試劑為對(duì)照組，標(biāo)準(zhǔn)系列熒光強(qiáng)度分別減去標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)的抗壞血酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。記錄直線回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 試劑加入順序

按照試驗(yàn)方式，在試劑加入量無(wú)差別的情況下，查驗(yàn)試劑的不同加入順序，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，按照加入試劑的排列順序不同，選擇熒光強(qiáng)度最好最不變的一項(xiàng)為最佳加入試劑順序。測(cè)得當(dāng)λn=415，Y=2,sens=2各試劑用量均為1mL，在25mL容量瓶中依次加入維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶，CuSO4溶液，NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，鄰苯二胺溶液時(shí)體系的熒光強(qiáng)度最大。

2.2 氧化劑濃度及用量的選擇

維生素C極易被氧化，因此，氧化劑Cu2+濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響很大。圖1中為Cu2+濃度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.20mg/mL范圍內(nèi)轉(zhuǎn)變時(shí)對(duì)系統(tǒng)熒光強(qiáng)度的影響，由圖知當(dāng)Cu2+濃度小于0.04時(shí)體系的熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明仍在繼續(xù)氧化，而在Cu2+濃度大于0.04時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度呈降落去向，Cu2+濃度為0.04時(shí)系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度最大，是以選定該濃度為最好氧化劑濃度。

圖1 氧化劑濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

2.3 pH值與緩沖溶液的影響

緩沖溶液不同對(duì)系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度影響有顯著差異，實(shí)驗(yàn)如下pH值=6.0的緩沖溶液：NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液、HAc - NaAc緩沖溶、NaOH - KHPO4緩沖溶液、KH2PO4- Na2HPO4緩沖溶液，在其他試劑加入量無(wú)差別的情況下，各加入1mL上述緩沖溶液，結(jié)果表明緩沖溶液選擇NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀時(shí)該系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度最大。

溶液的pH值對(duì)系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度影響很大，配制pH值=5.0～6.0的NaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，當(dāng)pH值=5.6且用量為4mL時(shí)熒光強(qiáng)度到達(dá)最大值且比較穩(wěn)定。

2.4 加熱溫度和加熱時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

室溫下一般的氧化反應(yīng)大多數(shù)是慢反應(yīng)，而溫度對(duì)體系熒光強(qiáng)度也有較大影響，在他試劑加入量相同的條件下，設(shè)置不同的加熱溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)測(cè)定熒光強(qiáng)度，再設(shè)置不同的加熱時(shí)間(10min、20min、30min、40min、50min)測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)選擇最佳加熱溫度和加熱時(shí)間。當(dāng)水浴溫度為25℃時(shí)恒溫30min時(shí)系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)最大值。

2.5 氧化時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了不同氧化時(shí)間和不同反應(yīng)時(shí)間下的熒光值，結(jié)果顯示，當(dāng)t≥10min時(shí)，氧化劑氧化基本完成而且趨于穩(wěn)定，因此選定氧化時(shí)間為10min進(jìn)行氧化。將體系放置不同的時(shí)間進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，每隔10min測(cè)量一次，做10組，分別測(cè)量其熒光強(qiáng)度，結(jié)論：體系熒光強(qiáng)度在20min左右可達(dá)到最大值，為了使反應(yīng)徹底完全，因此選定放置時(shí)間為25min。

2.6 鄰苯二胺濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

鄰苯二胺的濃度是實(shí)驗(yàn)中的重要條件，在其他前提條件穩(wěn)定的情況下，對(duì)鄰苯二胺的濃度設(shè)置梯度(采用0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30g/L)，在此條件下逐個(gè)測(cè)定系統(tǒng)熒光強(qiáng)度，由圖2可知，當(dāng)鄰苯二胺濃度>0.15g/L時(shí)，系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，為了使DHAA徹底反應(yīng)，選擇0.2g/L為最好鄰苯二胺濃度。

圖2 鄰苯二胺濃度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在放置時(shí)間為20min左右時(shí)測(cè)定其穩(wěn)定值，每隔10min一次，測(cè)20組，得出結(jié)論：系統(tǒng)熒光強(qiáng)度可不變10min，見(jiàn)圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

2.8 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的選擇

對(duì)維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白試劑溶液按上述方法反應(yīng)后的熒光物,分別在290～330nm，350～500nm內(nèi)掃描得到激發(fā)和發(fā)射光譜，如圖4所示，由圖4中可以看出。在激發(fā)波長(zhǎng)為355nm，發(fā)射波長(zhǎng)為426nm時(shí)，系統(tǒng)處于最好熒光強(qiáng)度，空白試劑的熒光值比較穩(wěn)定，則選擇激發(fā)波長(zhǎng)為355nm，發(fā)射波長(zhǎng)為426nm。

圖4 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)

2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖5為抗壞血酸濃度和其相對(duì)熒光強(qiáng)度之間的曲線圖。

圖5 工作曲線

從圖5中可以看出維生素C在濃度為0.002～4μg/mL的范圍內(nèi)與系統(tǒng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度值Δ F呈現(xiàn)杰出的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=74.481x+8.5215，R2=0.9902。

2.10 測(cè)定樣品

將石榴樣品按上述方式測(cè)定后，測(cè)定熒光強(qiáng)度F，同時(shí)測(cè)定樣品空白溶液熒光強(qiáng)度F0,并得出實(shí)際的熒光強(qiáng)度ΔF=F-F0。根據(jù)維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出石榴中維生素C 的含量。

3 結(jié)論

本文實(shí)驗(yàn)了熒光法測(cè)定石榴中維生素C的含量的檢測(cè)方法，維生素C在0.002～4μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限較低，采用熒光法測(cè)定石榴中維生素C含量，具有簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足實(shí)際測(cè)量的需要。

測(cè)量樣品結(jié)果顯示同一顆石榴，背陰面與朝陽(yáng)面向比，其熒光強(qiáng)度有所減弱，即朝陽(yáng)面所測(cè)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，所以，石榴的朝陽(yáng)面果實(shí)其維生素含量高。

由于所取石榴均為陜西省西安市臨潼區(qū)所產(chǎn)，分別取三地樣品(斜口、胡王、秦陵)，實(shí)驗(yàn)所得樣品熒光強(qiáng)度并無(wú)太大性差異，因此，此三地的石榴維生素含量均比較豐富，可以滿足人體對(duì)維生素的需求。

[1] 李圣男，蔡大川，鄭家概，等.HPLC法測(cè)定番石榴中總維生素C的含量[J].廣州化工， 2017,45(11):136-138.

[2] 崔 香，寇雪玲.熒光分析法測(cè)定枸杞中維生素C[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009(2):58-60.

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