熒光定量RT-PCR檢測(cè)高致病性PRRSV接觸感染仔豬增殖動(dòng)態(tài)

夏文龍， 余樹(shù)培， 吳 植， 郭長(zhǎng)明， 盧會(huì)鵬， 孫懷昌， 朱善元

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省重要?jiǎng)游镆卟∨c人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，以母豬繁殖障礙和仔豬及育肥豬呼吸道疾病為主要特征[1]。該病于1987年在美國(guó)和加拿大首次發(fā)現(xiàn)并迅速蔓延到世界各地，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。2006年，我國(guó)大規(guī)模暴發(fā)以高熱、高死亡率為主要特征的PRRS疫情，研究表明其主要病原為高致病性PRRSV變異株[3]，鑒于PRRSV具有復(fù)雜的感染及免疫逃避機(jī)制[4]，目前防控手段無(wú)法將其凈化和根除。

PRRS主要依靠疫苗接種進(jìn)行預(yù)防控制，近年來(lái)，有許多學(xué)者利用micro-RNA[5]、干擾素[6]、受體阻斷[2]等新策略進(jìn)行抗病毒研究，而這些研究前提是具備穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型，以便評(píng)價(jià)其保護(hù)效果。目前，PRSSV人工感染仔豬主要是通過(guò)肌肉注射和滴鼻方式接種[7-8]，缺少接觸感染的相關(guān)研究資料，為了模擬PRRSV在豬群內(nèi)的自然擴(kuò)散，本試驗(yàn)通過(guò)同居飼養(yǎng)方式在健康豬中引入PRRS病豬，并建立熒光定量RT-PCR方法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)感染仔豬的病毒血癥和排毒水平，為進(jìn)一步了解PRRSV的傳播機(jī)制和建立防治PRRSV感染的仔豬模型提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AxyPrep質(zhì)粒DNA小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；rTaqDNA聚合酶、pMD-18T載體、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix ExTaqⅡ?yàn)槿毡綯aKaRa公司產(chǎn)品；PRRS ELISA檢測(cè)試劑盒為美國(guó)IDEXX公司產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病毒和試驗(yàn)動(dòng)物

豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、高致病性PRRSV JXA1毒株均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；PRRS陰性仔豬購(gòu)于江蘇省如東某養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物試驗(yàn)在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院新獸藥研發(fā)臨床試驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備

按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit操作說(shuō)明，從PRRSV JXA1病毒液中提取RNA，參考TaKaRa PrimeScript RT Master Mix試劑盒提供的反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA作為模板，利用針對(duì)PRRSV ORF7編碼序列的特異性引物(F：5′-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3′，R：5′-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的片段后，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆并送測(cè)序，鑒定正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度倍比稀釋作為模板，按照TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系并在ABI 7300儀器上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)條件的設(shè)置，優(yōu)化后的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火并延伸31 s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，延伸結(jié)束收集熒光信號(hào)；最后于60～95 ℃過(guò)程中制作熔解曲線。

1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

為驗(yàn)證該方法重復(fù)性，隨機(jī)選取3個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，重復(fù)3次擴(kuò)增，記錄各模板CT值，計(jì)算其變異系數(shù)，變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均數(shù)。

1.6 敏感性、特異性試驗(yàn)

將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增以及實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，以確定2種方法所能檢測(cè)的最低拷貝數(shù)，進(jìn)行靈敏度比較；分別以豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬偽狂犬病毒(PRV)DNA為模板，并設(shè)立空白對(duì)照，在相同條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，分析擴(kuò)增曲線及CT值，驗(yàn)證本方法的特異性；將PRRSV cDNA和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)后，觀察溶解曲線，確保無(wú)引物二聚體及非特異擴(kuò)增。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)分組

將8頭28日齡斷奶仔豬平均分為2組，每組4頭，置于2個(gè)負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)3～5 d，觀察無(wú)異樣表現(xiàn)，前腔靜脈采集血液并分離血清，經(jīng)ELISA檢測(cè)PRRSV特異性抗體為陰性；提取RNA后，通過(guò)上述RT-PCR方法檢測(cè)PRRSV抗原陰性。第1組作為攻毒組，隨機(jī)選擇1頭仔豬肌肉注射和滴鼻接種PRRSV JXA1(1×105TCID50)，與其余3頭健康仔豬同居飼養(yǎng)；第2組作為空白對(duì)照組，接種相同量DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液；試驗(yàn)期間每日觀察并記錄各仔豬臨床癥狀。

1.8 病毒血癥檢測(cè)

在同居飼養(yǎng)后1、3、5、7、10、13 d，前腔靜脈采集每組仔豬血液5 mL并分離血清，取200 μL提取病毒RNA，根據(jù)上述定量RT-PCR方法，檢測(cè)各血清樣品中病毒基因組拷貝數(shù)。

1.9 糞便排毒檢測(cè)

在同居飼養(yǎng)后1、3、5、7、10、13 d，采集每組仔豬糞便1 g并用10 mL PBS溶液重懸，8 000g離心10 min后取200 μL上清，根據(jù)上述定量RT-PCR方法，檢測(cè)各糞便樣品中PRRSV基因組拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒鑒定

通過(guò)常規(guī)RT-PCR成功擴(kuò)增預(yù)期大小的130 bp目的片段(圖1)，克隆至pMD-18T載體，獲得重組質(zhì)粒pMD-ORF7，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增的cDNA基因片段和已發(fā)表PRRSV ORF7(GenBank登錄號(hào)：EF112445)編碼序列的同源性為99.7%。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)其D260 nm值，根據(jù)計(jì)算公式[9]：質(zhì)?？截悢?shù)(拷貝/μL)=6.02×1023×質(zhì)粒濃度/平均分子量，換算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)為2.18×109拷貝/μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和重復(fù)性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒連續(xù)10倍系列稀釋，分別取2.18×101～2.18×106拷貝/μL共6個(gè)稀釋度作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以CT值為縱坐標(biāo)、模板拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2-a)，回歸方程為y=33.855-3.16x，r2=0.996，結(jié)果表明，其線性關(guān)系良好、相關(guān)系數(shù)較高。隨機(jī)選取3個(gè)不同稀釋度作為模板重復(fù)擴(kuò)增3次，結(jié)果表明，每個(gè)稀釋度之間的CT值誤差非常小(圖2-b)，變異系數(shù)均小于 0.005，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

2.3 靈敏度比較

以不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR試驗(yàn)，結(jié)果表明，常規(guī)RT-PCR方法的最小檢出量為2.18×104拷貝(圖3-a)，熒光定量PCR方法的最小檢出量為2.18×101拷貝(圖3-b)，比常規(guī)方法高1 000倍。

2.4 特異性分析

分別以PRRSV、CSFV RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，PCV2和PRV的DNA為模板，相同條件下進(jìn)行定量RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示：僅PRRSV基因組出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其余樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖4-a)；隨后以PRRSV反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)后的熔解曲線波峰單一，無(wú)引物二聚體或非特異擴(kuò)增(圖4-b)，說(shuō)明本方法具有較好的特異性。

2.5 臨床癥狀觀察

人工接種豬于攻毒后2 d開(kāi)始即出現(xiàn)體溫升高，并于5 d左右出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽等PRRS典型癥狀，持續(xù)至11d死亡； 同居接觸后仔豬于4～5d開(kāi)始體溫升高，7～8d表現(xiàn)出相應(yīng)臨床癥狀，并分別于12、13 d全部死亡。

2.6 病毒血癥檢測(cè)

定期采集仔豬血清樣品，利用建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)病毒血癥進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。人工接種仔豬在1 d時(shí)即為PRRSV檢測(cè)陽(yáng)性，隨后病毒載量逐漸上升，并維持較高水平，病毒載量為108.4～108.7拷貝/mL直至11 d死亡；接觸感染后仔豬在3 d首次檢出PRRSV，7 d內(nèi)迅速升高至 108.5拷貝/mL，并穩(wěn)定在較高含量，至13 d時(shí)3頭仔豬全部死亡；空白對(duì)照組仔豬全部血清樣品均檢測(cè)為PRRSV陰性。

2.7 糞便排毒檢測(cè)

定期采集試驗(yàn)仔豬糞樣，熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。人工接種后仔豬在3 d為PRRSV檢測(cè)陽(yáng)性，隨后病毒含量呈上升趨勢(shì)并維持較高水平，病毒載量為104.5拷貝/g至 11 d 死亡；同居后感染仔豬于5 d PRRSV檢測(cè)陽(yáng)性，7 d排毒量迅速上升至104.0拷貝/g，并穩(wěn)定在較高水平至13 d死亡；空白對(duì)照組仔豬糞便檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3 討論

常規(guī)RT-PCR方法檢測(cè)PRRSV在動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布時(shí)，僅能做定性或半定量分析，而熒光定量PCR(FQ-PCR)可以確定病毒在動(dòng)物組織內(nèi)的精確拷貝數(shù)，因此該技術(shù)已越來(lái)越多地應(yīng)用于病毒定量分析的研究中[10]，另外，相比傳統(tǒng)的TCID50法檢測(cè)病毒含量，F(xiàn)Q-PCR方法更加快速、穩(wěn)定[11]。本試驗(yàn)建立的PRRSV FQ-PCR檢測(cè)方法靈敏度比常規(guī)RT-PCR高1 000倍，并且特異性強(qiáng)，和其他常見(jiàn)病毒無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，為PRRSV接觸感染仔豬后的增殖動(dòng)態(tài)檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

PRRSV動(dòng)物感染試驗(yàn)不易成功，與宿主、病毒和試驗(yàn)環(huán)境等方面密切相關(guān)[12]。豬是PRRSV感染和出現(xiàn)臨床癥狀的唯一宿主，用于PRRSV動(dòng)物試驗(yàn)的理想模型是SPF、CDCD(cesarean-derived colostrum-deprived)豬和PRRS陰性豬[13]，前2種試驗(yàn)豬獲取比較困難，因此，本試驗(yàn)首先通過(guò)RT-PCR和ELISA方法從某PRRS非免疫豬場(chǎng)篩選獲得PRRSV抗原和抗體雙陰性豬，用于感染試驗(yàn)，而所用PRRSV毒株為高致病代表株JXA1[14]，能夠引起PRRS典型病變；另外，動(dòng)物試驗(yàn)均在負(fù)壓隔離器中進(jìn)行，免受外界環(huán)境干擾。以上因素均保證了PRRSV能夠通過(guò)接觸傳播感染仔豬。

為模擬自然狀態(tài)下的PRRSV傳播，本試驗(yàn)首先向1頭易感仔豬肌肉注射和滴鼻接種PRRSV JXA1，隨后將其和另外3頭健康仔豬同居飼養(yǎng)，研究結(jié)果表明，人工接種豬于攻毒后2 d開(kāi)始即出現(xiàn)體溫升高，并于5 d左右出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽等PRRS典型癥狀，至11 d死亡，同居接觸仔豬的發(fā)病時(shí)間推遲2～3 d，并分別于12、13 d全部死亡；通過(guò)熒光定量RT-PCR對(duì)接觸感染仔豬的病毒血癥和糞便排毒進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，其血清和糞便分別于3、5 d首次檢測(cè)PRRSV陽(yáng)性，相比人工接種豬推遲2 d左右，病毒在仔豬體內(nèi)增殖動(dòng)態(tài)和人工接種豬相似，感染后7 d迅速上升并維持在較高水平，說(shuō)明仔豬確實(shí)死于PRRSV感染。綜上所述，本試驗(yàn)為建立PRRSV接觸感染仔豬模型奠定了基礎(chǔ)，為高致病性PRRS新型疫苗的研發(fā)及免疫效果評(píng)價(jià)等研究提供了參考數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Done S H，Paton D J. Porcine reproductive and respiratory syndrome：clinical disease，pathology and immunosuppression[J]. Veterinary Record，1995，136(2)：32-35.

[2]Chen Y，Guo R，He S，et al. Additive inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection with the soluble sialoadhesin and CD163 receptors[J]. Virus Research，2014，179(1)：85-92.

[3]童光志，周艷君，郝曉芳，等. 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(5)：323-327.

[4]Lunney J K，F(xiàn)ang Y，Ladinig A，et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)：pathogenesis and interaction with the immune system[J]. Annual Review of Animal Biosciences，2016，4(1)：129-154.

[5]Zhu L，Bao L，Zhang X，et al. Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication with exosome-transferred artificial microRNA targeting the 3′ untranslated region[J]. Journal of Virological Methods，2015，223：61-68.

[6]王彥彬，孫向麗，魏戰(zhàn)勇，等. 豬干擾素α和γ在桿狀病毒中共表達(dá)及對(duì)PRRSV抑制作用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(9)：1931-1938.

[7]Lin H，Ma Z，Hou X，et al. Construction and immunogenicity of a recombinant swinepox virus expressing a multi-epitope peptide for porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Scientific Reports，2017，7：43990.

[8]Park C，Seo H W，Han K，et al. Evaluation of the efficacy of a new modified live porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine (Fostera PRRS) against heterologous PRRSV challenge[J]. Veterinary Microbiology，2014，172(3/4)：432-442.

[9]Zhou G，Cai W，Liu X，et al. A duplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction for the detection and quantitation of avian leukosis virus subgroups A and B[J]. Journal of Virological Methods，2011，173(2)：275-279.

[10]Xiao S，Chen Y，Wang L，et al. Simultaneous detection and differentiation of highly virulent and classical Chinese-type isolation of PRRSV by real-time RT-PCR[J]. Journal of Immunology Research，2014(9)：809656.

[11]Martínez E，Riera P，Sitjà M，et al. Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green[J]. Research in Veterinary Science，2008，85(1)：184-193.

[12]Martínezlobo F J，Díezfuertes F，Segalés J，et al. Comparative pathogenicity of type 1 and type 2 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in a young pig infection model[J]. Veterinary Microbiology，2011，154(1/2)：58-68.

[13]Rose N，Renson P，Andraud M，et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) modified-live vaccine reduces virus transmission in experimental conditions[J]. Vaccine，2015，33(21)：2493-2499.

[14]Tian K，Yu X，Zhao T，et al. Emergence of fatal PRRSV variants：unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark[J]. PLoS One，2007，2(6)：e526.