索氏法提取蛹蟲草子實(shí)體多糖的工藝研究

陳勝城

摘 要：以蛹蟲草子實(shí)體為原料，研究索氏法提取工藝，提取蛹蟲草子實(shí)體多糖。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法探討乙醇的濃度、固液比、提取時(shí)間對多糖提取率的影響，建立了最佳的工藝參數(shù)，即50 %乙醇，固液比1：50，提取時(shí)間4h，此時(shí)多糖平均提取收率為10.86%。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草 索氏提取 多糖

蛹蟲草[Cordryceps miltaris（L.ex.Fr）Link]屬于子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬真菌的模式種，又名北蟲草、北冬蟲夏草，其由子座和菌核（即蟲或蛹的尸體）兩部分組成[ 1 - 2 ]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，蟲草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺滋陰，又能補(bǔ)腎壯陽，故能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽[ 3 ]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，北冬蟲夏草富含蛋白質(zhì)、維生素、磷、鈣、鐵、錳、鋅、硒等微量元素，以及蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸、超氧化物歧化酶、腺苷等生物活性物質(zhì)[4]。蟲草多糖作為北冬蟲夏草重要的生理活性物質(zhì)之一，具有抗腫瘤、降血糖、抗輻射、抗病毒等活性，能顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有良好的應(yīng)用前景[ 5 - 6 ]。目前，人們對于蟲草的研究已經(jīng)從簡單的發(fā)

酵培養(yǎng)得到菌絲體，進(jìn)入到對其成分的分子水平、基因水平和應(yīng)用開發(fā)的研究方面。對于蟲草多糖，在通過大規(guī)模發(fā)酵得到蟲草菌絲體后對于多糖的提取已成為下一步研究和應(yīng)用的關(guān)鍵及中間環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的蟲草多糖提取方法采用浸煮法，提取率在料液比相同時(shí)受濃度梯度的限制。而采用索氏法提取，由于在提取過程中蛹蟲草不斷被純?nèi)軇┹腿?，因此不僅可以提高有效成分的獲得率，而且溶劑被反復(fù)利用，節(jié)約了用量。本研究采取單因素分析法和多因素正交分析法對索氏法提取蟲草多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種穩(wěn)定、快速、高效的蟲草多糖的索氏提取法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：無水乙醇，濃硫酸，苯酚，葡萄糖，均為分析純。

1.1.2 材料：蛹蟲草子實(shí)體，新會(huì)特產(chǎn)。

1.1.3 器材用具：高速粉碎機(jī)，電子恒溫水浴鍋，電熱鼓風(fēng)干燥箱，電子天平，索氏提取器，722型光柵分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.1.1 苯酚溶液配制：稱取苯酚（分析純）5.00g，加100mL蒸餾水，配成5%溶液，裝棕色瓶中備用。

1.2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取葡萄糖200mg，置于100mL容量瓶中，定容搖勻，取1mL于50mL容量瓶中定容搖勻，為含葡萄糖40mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL，用蒸餾水補(bǔ)充至2.0mL，加入5%的苯酚溶液1.0mL搖勻，濃硫酸5.0mL，充分搖勻后放置5min，置于沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫。另取蒸餾水2.0mL，加苯酚、濃硫酸同法操作為一空白對照，于490nm處測定吸光度值，以吸光值A(chǔ)和葡萄糖濃度C計(jì)算回歸方程。

1.2.2 蟲草多糖的提取

將蟲草子實(shí)體置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中于75℃干燥至恒重，然后用高速粉碎機(jī)粉碎。精確稱取樣品2.00g，取100mL無水乙醇，用索氏提取器于90℃水浴箱中提取4h，然后稱取1%的活性炭脫色1h[ 7 ]，過濾，定容至250mL容量瓶中，取10mL提取液稀釋至100mL容量瓶中，備用。

1.2.3 苯酚-硫酸法[ 8 ]測定樣品中多糖

精密吸取樣品處理液2.0mL，置于10mL比色管中，加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加硫酸5.0mL，搖勻，放置15min，于490nm處測吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品多糖的含量。

1.2.4 提取率的計(jì)算

多糖提取率=測得的多糖含量/蛹蟲草粉末質(zhì)量×100%。

1.2.5 乙醇濃度對多糖提取率的影響

分別用20%、40%、60%、80%的乙醇溶液和無水乙醇，控制料液比1：50（g/mL），按1.2.2提取和1.2.3測定其多糖提取率。

1.2.6 料液比對多糖提取率的影響

分別控制料液比為1：20、1：30、1：40、1：50、1：60（g/mL），使用40 %的乙醇溶液，按1.2.2提取和1.2.3測定其多糖的提取率。

1.2.7 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

分別控制索氏提取時(shí)間2h、3h、4h、5h、6h，使用40%乙醇溶液，料液比為1：50（g/mL），按1.2.2提取和1.2.3測定其多糖提取率。

1.2.8 索氏法提取蛹蟲草多糖的正交實(shí)驗(yàn)

在索氏法提取蛹蟲草子實(shí)體多糖的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用L9（33）正交試驗(yàn)法研究索氏提取法中的三個(gè)主要因素，即A（乙醇濃度）、B（料液比）、C（提取時(shí)間）對蟲草多糖的提取的影響，以確定最佳提取條件，因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

在波長490nm處測定吸光度值，以葡萄糖濃度c為橫坐標(biāo)（mg/L），吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=0.0156c-0.0114，相關(guān)系數(shù)r2=0.9991，線性關(guān)系良好。

2.2 乙醇濃度對多糖提取率的影響

乙醇濃度對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖1所示。由圖可見，當(dāng)乙醇濃度小于40%時(shí)，多糖的提取率隨著乙醇濃度的增大而增加；當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高，此后隨著乙醇濃度的進(jìn)一步增加，多糖提取率逐漸降低。因此，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)乙醇濃度選擇30%、40%、50%三個(gè)水平。

2.3 料液比對多糖提取率的影響

料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖2所示。由圖可見，隨著料液比的增加，即蟲草多糖提取率隨溶劑增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1：50時(shí)，提取率最高，此后料液比繼續(xù)增加時(shí)提取率逐漸下降。因此，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)料液比選擇1：45、1：50、1：55三個(gè)水平。

2.4 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

提取時(shí)間對蛹蟲草多糖提取率的影響如圖3所示。由圖可見，多糖提取率隨提取時(shí)間的延長而增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4h以后，時(shí)間進(jìn)一步延長，提取率增加緩慢。因此，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取時(shí)間選擇為3.5h、4h、4.5h三個(gè)水平。

2.5 索氏法提取蛹蟲草多糖工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2的試驗(yàn)結(jié)果極差分析可知，3個(gè)考察因素的極差大小順序?yàn)椋篈（乙醇濃度）>C（提取時(shí)間）>B（料液比），說明乙醇濃度對多糖提取率的影響最大，提取時(shí)間的影響最??；最優(yōu)方案為A3B2C2，即乙醇濃度50%、料液比1：50、提取時(shí)間4h。

2.6 最優(yōu)參數(shù)組合驗(yàn)證

由于所得到的最優(yōu)工藝參數(shù)組合不在正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的9組內(nèi)，因此在正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組合A3B2C2的工藝參數(shù)條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3，多糖平均提取率為10.86%，高于正交實(shí)驗(yàn)的9組技術(shù)組合，且提取結(jié)果穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究以蛹蟲草子實(shí)體為材料，研究索氏法提取蟲草多糖的工藝條件，探討乙醇濃度、固液比、提取時(shí)間對多糖提取率的影響，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)建立了最佳提取工藝參數(shù)，即50%乙醇、固液比1：50、提取時(shí)間4h，此時(shí)多糖平均提取收率為10.86%。

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廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號：2017A070701039。