電化學(xué)功能核酸生物傳感器在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的發(fā)展現(xiàn)狀

本文從轉(zhuǎn)基因食品的概念出發(fā)，對轉(zhuǎn)基因的發(fā)展及其所引發(fā)的安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了簡要說明，然后對轉(zhuǎn)基因食品的檢測方法進(jìn)行了簡單的闡述，并著重介紹了目前電化學(xué)功能核酸生物傳感器方法檢測轉(zhuǎn)基因的發(fā)展，最后，對將來的檢測方向進(jìn)行了展望。

1轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展歷程

轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organisms，GMOs）是指利用基因工程技術(shù)將某些外源性的基因轉(zhuǎn)移到動物、植物或微生物體內(nèi)，與生物體自身的基因進(jìn)行重組后得到穩(wěn)定的遺傳表達(dá)，進(jìn)而獲得滿足人類不同需求的新的生物體。以轉(zhuǎn)基因生物作為原料或初級產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)加工而得到的食品即為轉(zhuǎn)基因食品。

新事物的產(chǎn)生往往會引起公眾的熱議，尤其是與人類生存密切相關(guān)的飲食問題，因此，自轉(zhuǎn)基因技術(shù)問世以來，不僅有民眾反對，更有商業(yè)公司以及科學(xué)家反對。1972年，EMBO（歐洲分子生物學(xué)組織）工作會議首次專門討論了重組DNA的潛在危害，此后，更有各種相關(guān)組織機(jī)構(gòu)對轉(zhuǎn)基因技術(shù)提出質(zhì)疑并作出規(guī)定，比如《卡塔赫那生物安全議定書》。新技術(shù)的產(chǎn)生從來都不是一帆風(fēng)順的，雖然轉(zhuǎn)基因技術(shù)受到多種限制，但一系列的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品依舊問世，如轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、轉(zhuǎn)基因番茄等，隨之而來的是一系列的轉(zhuǎn)基因安全事件，比如英國的Puztai事件、美國的班蝶風(fēng)波、加拿大的超級雜草事件、墨西哥的玉米事件和中國湖北轉(zhuǎn)基因水稻非法種植事件等。

1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物——煙草在美國問世，自此人類對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究逐步走向深入。1986年，Switzerland批準(zhǔn)第一例轉(zhuǎn)牛凝乳酶基因工程微生物的商業(yè)化應(yīng)用揭開了轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的序幕。1994年，美國Calgene公司開發(fā)的延熟番茄Flavr-SaV rTM被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，該產(chǎn)品成為全球首次批準(zhǔn)的可進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因作物開始批量種植。截止到2015年，全球轉(zhuǎn)基因植物的種植面積達(dá)1.8億公頃，其中美國等西方國家轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的種植約占全部農(nóng)作物的90%以上。

在已有的生物體內(nèi)引入其原本沒有的遺傳物質(zhì)，這件事情對于很多民眾來說是無法接受的，尤其是對于部分宗教信仰者，他們甚至覺得這有悖常理。但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)對于解決饑餓問題，以及很多偏遠(yuǎn)地區(qū)的膳食營養(yǎng)問題至關(guān)重要。此外，轉(zhuǎn)基因在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣泛。因此，對于轉(zhuǎn)基因食品的安全性評價(jià)顯得至關(guān)重要。

2 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測方法

當(dāng)前，對轉(zhuǎn)基因食品的檢測主要有兩種方法——間接檢測和直接檢測，前者是指對所轉(zhuǎn)入的目的基因表達(dá)出的特異性外源蛋白進(jìn)行檢測，后者是對所轉(zhuǎn)入目的基因的檢測。

2.1 基于外源蛋白靶標(biāo)的檢測技術(shù)

基于外源蛋白靶標(biāo)的檢測技術(shù)主要是以免疫分析技術(shù)為基礎(chǔ)，利用轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生的特定外源蛋白與抗體的特異性識別進(jìn)行檢測和定量。

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）

該技術(shù)采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定，該方法已可成功用于轉(zhuǎn)基因水稻、大豆的檢測。

2.1.2 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Western Blot）

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)，其原理是把經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離的目的蛋白原位固定于固相膜上，再用高濃度的蛋白質(zhì)溶液孵育固相膜，然后用含有放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記的特定抗體進(jìn)行雜交，使抗原-抗體特異性結(jié)合，最后通過放射自顯影或顯色，觀察外源基因的表達(dá)，根據(jù)檢出結(jié)果可得知目的蛋白是否表達(dá)、濃度及分子量大小。

2.1.3 免疫層析試紙條技術(shù)

將特異的抗體交聯(lián)到試紙條和有顏色的物質(zhì)上，當(dāng)紙上抗體和特異抗原結(jié)合后，再與帶有顏色的特異抗體反應(yīng)，形成三明治狀的色帶，如果沒有抗原，則無顏色反應(yīng)。

2.1.4 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（protein chip）

繼基因芯片技術(shù)后發(fā)展起來的生物檢測技術(shù)——蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，其將已知序列的蛋白、多肽分子、抗原、抗體、酶等以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在硝酸纖維素膜、玻璃、硅片等載體上排列，待熒光標(biāo)記的靶分子和探針分子結(jié)合后，利用激光掃描系統(tǒng)對熒光信號進(jìn)行強(qiáng)度檢測分析。

2.2 基于外源DNA靶標(biāo)的檢測技術(shù)

核酸特別是DNA，由于其具有較高的穩(wěn)定性及以DNA為靶標(biāo)的檢測技術(shù)具有較高靈敏度和特異性，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測實(shí)踐中。依據(jù)所檢測轉(zhuǎn)基因核酸成分的靶序列位置及序列特征，將基于外源核酸成分的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)按特異性由高到低分為核酸成分篩查技術(shù)、基因特異性檢測技術(shù)、構(gòu)建特異性檢測技術(shù)及轉(zhuǎn)化事件特異性檢測技術(shù)。

2.2.1 定性PCR檢測技術(shù)

普通PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因檢測中常用的定性檢測技術(shù)，目前，該方法除被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)準(zhǔn)化檢測外，還被應(yīng)用于新的轉(zhuǎn)基因成分的鑒定研究中。

2.2.2 定量PCR檢測技術(shù)

定量PCR技術(shù)主要分為3大類：基于終點(diǎn)檢測的傳統(tǒng)定量PCR技術(shù)、定量競爭PCR技術(shù)（QC-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-PCR）。

2.2.3 等溫?cái)U(kuò)增基因芯片技術(shù)

該技術(shù)是在轉(zhuǎn)基因檢測中，將目前使用的報(bào)告基因、啟動子、終止子的特異性片斷制成檢測芯片，與待測產(chǎn)品的DNA進(jìn)行雜交，掃描信號后經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對生物樣品快速、高效的檢測。

2.2.4 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR技術(shù)又稱單分子PCR技術(shù)，是近年來發(fā)展迅速的一種核酸絕對定量技術(shù)。

3新型電化學(xué)功能核酸傳感器在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用

上述方法中，無論是基于外源蛋白的靶標(biāo)技術(shù)還是基于外源基因的靶標(biāo)技術(shù)，都既需要昂貴的儀器設(shè)備，還要求操作人員具有很高的專業(yè)技能，只有這樣才能滿足對于轉(zhuǎn)基因食品檢測的精確度及準(zhǔn)確度的要求。因此，便攜性、人工智能化以及可以用于現(xiàn)場檢測的檢測設(shè)備就顯得十分重要。

目前，電化學(xué)功能核酸傳感器以其快速、靈敏、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)備受廣大研究人員的青睞，對于電化學(xué)功能核酸傳感器的研究也在逐年增多。電化學(xué)功能核酸生物傳感器是以功能核酸作為識別元件，并利用PCR、HCR、RCA或一些納米材料作為信號放大手段，將靶物質(zhì)的存在與否通過電信號的改變輸出，并通過信息軟件處理獲得更加直觀的效果。

Sun等人將硫化鉛納米粒子（PbS NPs）用作電化學(xué)檢測花椰菜花葉病毒序列35S（CaMV 35S）啟動子的寡核苷酸標(biāo)記。PbS NPs用巰基乙酸修飾，易與CaMV 35S寡核苷酸探針連接。將目標(biāo)DNA序列共價(jià)連接在巰基乙酸自組裝金電極上，在電極表面完成目標(biāo)DNA與探針DNA的雜交。PbS NPs錨定在雜交體溶解在硝酸氧化溶液，并采用敏感差分脈沖陽極溶出伏安法檢測。該方法可以用來檢測雜交反應(yīng)，其檢出限為 4.38×10- 1 2mol/L。

Ahmed等人首次報(bào)道了一種高效、準(zhǔn)確且廉價(jià)的快速檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用了等溫?cái)U(kuò)增，隨后通過電化學(xué)系統(tǒng)分析未純化的擴(kuò)增子的整合。在該實(shí)驗(yàn)中，循環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）效率比恒定溫度（65℃）下進(jìn)行的PCR高。將擴(kuò)增產(chǎn)物與氧化還原活性分子Hoechst 33258合并，并通過DNA棒，使用線性掃描伏安法與一次性電化學(xué)印刷芯片集成。H33258分子與DNA小溝結(jié)合導(dǎo)致H33258的氧化峰電流顯著下降，H33258誘導(dǎo)的DNA結(jié)合現(xiàn)象，除了陽極電流峰的變化外，還用于檢測玉米CBH 351品種。由于不需要繁瑣的探針固定，擴(kuò)增和檢測都在一臺設(shè)備上進(jìn)行，因此生物傳感器消除了潛在的交叉污染，相信這種類型的傳感器將有效提升食品安全水平。

Mix等人通過方波伏安法（SWV）證實(shí)了一種用于實(shí)際玉米面粉樣品中的轉(zhuǎn)基因玉米的電化學(xué)檢測的方法。在用四氧化鋨聯(lián)吡啶標(biāo)記不對稱PCR擴(kuò)增的靶標(biāo)后，將它們與固定的寡核苷酸探針在金電極上雜交，可以檢測到近等基因玉米中的玉米基因ivrp和SSIIb。在所有轉(zhuǎn)基因玉米樣品中檢測到轉(zhuǎn)基因cryIA/b和MON810特異性片段，混合樣品中低至含有MON810的0.6%。盡管在雜交時(shí)間小于10分鐘后可以檢測含有100%近等基因或分別檢轉(zhuǎn)基因玉米的樣品中的所有序列，但是對于檢測僅含有0.9%～0.6%的轉(zhuǎn)基因玉米雜交時(shí)間為30分鐘。

Liao等人提出了一個(gè)生物分子分析系統(tǒng)構(gòu)建不同的生化活動，即以加快GMOs的計(jì)算機(jī)檢測，而計(jì)算機(jī)制為轉(zhuǎn)基因生物篩選中常見的復(fù)雜程序提供了一種替代方法。鑒于生物分析系統(tǒng)能夠處理啟動子、編碼基因和物種基因，所以在電化學(xué)和光學(xué)方式方面能成功地識別特定的GM事件。生物分子計(jì)算檢測表現(xiàn)出低于亞納摩爾水平的基因修飾DNA的檢測能力，并且通過非GM基因的大量共存而發(fā)現(xiàn)無干擾。此外，這種生物分析系統(tǒng)以排列方式進(jìn)行復(fù)雜的操作，對可變的GM事件進(jìn)行多重篩選。這樣一種生物分子計(jì)算方法和生物傳感器對轉(zhuǎn)基因生物的快速、經(jīng)濟(jì)和高保真篩選具有很好的前景。

Manzanares-Palenzuela等人報(bào)告了一個(gè)簡單而靈敏的多元電化學(xué)方法用于抗除草劑草甘膦大豆（RRS）的定量檢測。兩種DNA序列通過雜交到磁珠上進(jìn)行定位，通過在單個(gè)管中進(jìn)行固定化、雜交和標(biāo)記步驟以及并行電化學(xué)讀數(shù)同時(shí)檢測兩個(gè)序列。使用異硫氰酸熒光素（FITC）或地高辛（Dig）標(biāo)記的信號傳導(dǎo)探針以夾心形式進(jìn)行雜交，然后分別使用與過氧化物酶或堿性磷酸酶綴合的抗-Dig和抗-FITC的Fab片段進(jìn)行雙酶標(biāo)記，在絲網(wǎng)印刷的碳電極上最終進(jìn)行酶活性的電化學(xué)測定。測定的線性范圍為2～250pM，兩種目標(biāo)物的檢測限分別為650fM和190fM。結(jié)果表明，該方法可應(yīng)用于低于歐洲標(biāo)記閾值水平（0.9%）的轉(zhuǎn)基因生物量化，為食品中特定轉(zhuǎn)基因事件的快速定量提供了一種通用方法。

Huang等人首次描述了基于多標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器，用于在相同的傳感界面上同時(shí)檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的多種DNA成分。通過核酸外切酶催化反應(yīng)和基于金納米顆粒的生物條碼相關(guān)策略分別應(yīng)用兩輪信號放大。使用這種電化學(xué)生物傳感器，成功地實(shí)現(xiàn)了同時(shí)多次檢測不同轉(zhuǎn)基因組DNA的成分。此外，該方法的穩(wěn)定性和有效性通過應(yīng)用于各種GMO產(chǎn)品（包括當(dāng)?shù)孬@得并確認(rèn)的商業(yè)轉(zhuǎn)基因種子和轉(zhuǎn)基因植物）而得到證明。他們所提出的電化學(xué)生物傳感器表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，有希望獲得更多關(guān)注，其可用于快速和現(xiàn)場同時(shí)多重篩選轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的不同組分。

Tam報(bào)道了基于單層碳納米管的生物傳感器用于GMO檢測：使用以電化學(xué)電極和單層碳納米管場效應(yīng)晶體管（SWCNT-FET）為基礎(chǔ)的生物傳感器來測定Roundup Ready大豆的CaMV 35S啟動子。在最佳條件下，這兩種生物傳感器都可以有效檢測到濃度低至1nM的樣品?；陔姌O的生物傳感器的靈敏度約為0.6千歐/nM，而基于SWCNT-FET的生物傳感器的靈敏度為0.32nA/nM。兩種生物傳感器也用于確定PCR擴(kuò)增的樣品。結(jié)果表明，兩種傳感器都能很好地鑒定轉(zhuǎn)基因生物，從而為食品樣品的篩選分析提供有用的工具。

Wang等人通過識別CaMV 35S啟動子報(bào)告了一種簡單的無標(biāo)簽電化學(xué)阻抗式DNA生物傳感器，用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測。在檢測系統(tǒng)中，采用Au NPs修飾的多壁碳納米管還原氧化石墨烯納米帶來固定探針ssDNA，當(dāng)通過雜交反應(yīng)將目標(biāo)DNA固定在修飾電極表面上時(shí)，由于形成的雙鏈DNA抑制電子轉(zhuǎn)移過程，阻抗信號顯示增長趨勢。在最佳條件下，DNA生物傳感器的阻抗信號增加與目標(biāo)DNA濃度的對數(shù)在1×10- 1 6～5×10- 1 0M范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為3.3×10- 1 7M。此外，生物傳感器對于DNA錯(cuò)配具有極好的選擇性，且可以應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因大豆樣品的實(shí)際檢測。

Moura-Melo等人設(shè)計(jì)了一個(gè)利用PCR擴(kuò)增方法和序列特異性的電化學(xué)基因傳感器用于CaMV的35S啟動子中的特異性DNA序列的定量。Moura-Melo等使用通過硫醇化捕獲探針和對氨基苯硫酚金表面的化學(xué)吸附構(gòu)建的基因傳感器，將未純化的PCR擴(kuò)增子與用熒光素標(biāo)記的信號探針一起夾在傳感層上。所提出的測試允許測定半合子（玉米MON810性狀）和純合（大豆GTS40-3-2）轉(zhuǎn)化植物中的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，并且對于兩種GMO品系表現(xiàn)出至少0.25%的定量限。

Aghili等人設(shè)計(jì)了一種新型、敏感的電化學(xué)納米生物傳感器用于檢測/定量轉(zhuǎn)基因成分；在絲網(wǎng)印刷碳電極上修飾剝離型氧化石墨烯和金納米海膽，并且還用特定的DNA探針以及蘇木精作為電化學(xué)指示劑。所得傳感器的線性范圍為40.0～1100.0fM，檢測極限為13.0fM。此外，生物傳感器對非特異性序列的目標(biāo)DNA具有良好的選擇性，且成本低、時(shí)間效率高，可用于提取的轉(zhuǎn)基因生物體DNA產(chǎn)品的實(shí)際樣品環(huán)境。

4 展望

目前，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測仍舊面臨著巨大的挑戰(zhàn)，每年都會有新的GMO進(jìn)入市場，對它們的檢測和安全性評價(jià)至關(guān)重要。而隨著生物技術(shù)和電子信息技術(shù)的發(fā)展，以及人們對于轉(zhuǎn)基因的更深層次認(rèn)識，轉(zhuǎn)基因檢測設(shè)備的便攜化、智能化、與智能手機(jī)聯(lián)用，以及多重檢測都有很廣闊的發(fā)展前景。