發(fā)酵乳中乳酸菌計數(shù)不確定度的評定

◎ 馮秀娟，鄧 軍，高俊峰

（寧夏自治區(qū)食品檢測中心，寧夏 銀川 750000）

乳酸菌是一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱[1]。GB19320-2010中規(guī)定發(fā)酵乳產(chǎn)品中的乳酸菌數(shù)不得低于1×106CFU/g（mL），乳酸菌的含量是評價產(chǎn)品對于人們營養(yǎng)與健康作用的重要指標(biāo)[2]，因而測量結(jié)果的可用性值得高度關(guān)注。一切定量結(jié)果都不可避免具有不確定度，測量不確定度是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量量值分散性的非負(fù)參數(shù)。目前，GB/T27025-2008《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》（ISO/IEC17025-2005《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》）[3-4]指出：適當(dāng)時，要對測量結(jié)果的不確定度進行評定。CNAS-CL09-2013《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》中也指出：在微生物檢測領(lǐng)域，某些情況下，應(yīng)對測量不確定度進行合理的評估[5]?！秾嶒炇屹Y質(zhì)認(rèn)定評審準(zhǔn)則》中對不確定度也有要求：當(dāng)不確定度影響對結(jié)果符合性的判定時，報告中還需要包括不確定度的信息。本研究依據(jù)最新版GB4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》[1]的規(guī)定對發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)進行測定。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可根據(jù)JJF1056.1-2012《測量不確定度評定與表示》與SN/T4091-2015《食品微生物學(xué)測量不確定度評估指南》[6-7]中有關(guān)規(guī)定對乳酸菌總數(shù)進行不確定度分析，找出乳酸菌檢測過程中的關(guān)鍵控制點[8]，為驗證實驗室對微生物的檢測、計數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度方面的能力提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品、儀器與培養(yǎng)基

樣品：市售酸奶。

儀器：生化培養(yǎng)箱（型號：BSP-250），冰箱，均質(zhì)器，無菌均質(zhì)袋，立式自動壓力蒸汽滅菌器（GR850DF，致微儀器有限公司），厭氧袋，天平，無菌試管，無菌吸管，生理鹽水。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，MC培養(yǎng)基。

1.2 檢測方法

1.2.1 取樣與稀釋

樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。稱取酸奶樣品25 g于裝225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min制成1∶10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管吸取1∶10的樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中，制成1∶100的樣品勻液，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管。

1.2.2 稀釋倍數(shù)選擇

根據(jù)平常實驗經(jīng)驗，酸奶中乳酸菌計數(shù)（GB4789.35-2010版標(biāo)準(zhǔn)）一般選擇10-5、10-6稀釋度，根據(jù)GB4789.35-2016，本實驗選擇10-6、10-7、10-83個稀釋度。

1.2.3 傾注平板、培養(yǎng)與計數(shù)

將冷卻至48 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入有稀釋液的平皿中，轉(zhuǎn)動平皿混勻。（36±1）℃厭氧培養(yǎng)（72±2）h。培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果報告原則

選取菌落數(shù)在30～300 CFU、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)，單位CFU/mL。

2.2 建立數(shù)學(xué)模型

由于只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，因此計算該稀釋度平板上的菌落數(shù)乘以該稀釋度，即為乳酸菌計數(shù)結(jié)果，公式為：

式（1）中：N為樣品中菌落數(shù)；X為平板上的菌落數(shù)；d為稀釋度。

2.3 不確定度的來源

檢測中不確定度的來源主要有：樣品本身的均勻性、取樣的重復(fù)性、操作者、培養(yǎng)時間、設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑及玻璃量具等。與一般的側(cè)量比較，微生物同一樣品重復(fù)測量的結(jié)果相差極大，即結(jié)果的分散性較大。隨機效應(yīng)帶來的樣本重復(fù)性偏差是獲取測量不確定度的主要因素，即A類評定。本實驗主要采用A類評定測量不確定度，同時考慮了B類不確定度對合成不確定度的貢獻。

2.4 不確定度的評定

2.4.1 同一樣品的重復(fù)測量結(jié)果的不確定度評定

依據(jù)GB 4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》進行檢驗，在重復(fù)性條件下對同一個酸奶樣品進行了10次獨立性測試，由于乳酸菌的數(shù)量分布在108和109數(shù)量級，計算出的樣本標(biāo)準(zhǔn)差很大，因此對實驗數(shù)據(jù)取對數(shù)后進行計算[9-12]，結(jié)果和中間計算值，見表1。

表1 重復(fù)測量結(jié)果和中間計算值表

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度等于1倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差，即：

根據(jù)置信概率p=95%和自由度ν=9，由t分布表得到包含因子k=2.26，于是得：對數(shù)計算結(jié)果：

2.4.2 一組樣品的重復(fù)測定結(jié)果的不確定度評定

隨機選取10份酸奶樣品，各樣品由不同人員進行試驗，同一樣品由同一人員進行2次試驗。中間計算值及對數(shù)計算結(jié)果，見表2。

表2 10份酸奶樣品乳酸菌測量結(jié)果及中間計算值表

合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差：

因為每一樣品測量2次，所以2次測量結(jié)果平均值的實驗合并標(biāo)準(zhǔn)差為：

根據(jù)置信概率p=95%和自由度ν=10，由t分布表得到包含因子k=2.23，于是得：

2.4.3 B類不確定度的評定

主要考慮樣品制備過程中稱量、玻璃量具（含溫度校正）、稀釋過程、接種過程等引入的不確定度。

2.4.3.1 樣品制備過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1）稱量。所用天平最大量程為1 000 g，允許誤差為0.1 g，稱取25.0 g樣品，測量儀器最大允許誤差導(dǎo)致的不確定度屬于均勻分布，所以由天平稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）玻璃器皿及溫度所用250 mL無菌量筒量取225 mL無菌生理鹽水緩慢加入稱量好的25.0 g樣品中，根據(jù)JJG196-2006[13]中規(guī)定，20 ℃時量出式量筒的容量允許差為2.0 mL，按照三角分布考慮，k=6，由此估算量筒的允許誤差引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

在實驗室室溫為25 ℃時取樣，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按均勻分布溫度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）均質(zhì)器將制備好的樣品進行均質(zhì)，每個樣品按GB4789.35-2016中規(guī)定均質(zhì)速度和時間進行均質(zhì)，可認(rèn)為由均質(zhì)引入的不確定度可忽略不計。

樣品制備過程中引入的不確定度由電子天平、量筒和溫度產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成，故：

2.4.3.2 樣品稀釋過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品稀釋過程中引入的不確定度主要是由1 mL流出式吸量管（B級）引入的不確定度。按照J(rèn)JG196-2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》的要求，均有相應(yīng)的最大允差，按照三角分布考慮，k=，由此估算相對不確定度分量，見表3。本實驗過程中，試驗溫度與鑒定證書的溫度一致，

因此溫度引起的容量瓶體積不確定度可忽略。

表3 樣品稀釋過程中量具校準(zhǔn)引起的不確定度表

2.4.3.3 樣品接種過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

選取適宜稀釋度的樣品1 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，實際取樣1 mL待測樣品時的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.4.3.4 合成不確定度

B類各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，見表4。

表4 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表表

B類合成不確定度：

2.4.4 合成A類與B類不確定度

（1）同一樣品重復(fù)測量

相對A類不確定度B類的貢獻為：

（2）一組樣品的重復(fù)測定

合成不確定度：

相對A類不確定度B類的貢獻為：

3 討論

通過本次對乳酸菌不確定度的評定可知，影響乳酸菌檢測的因素很多，除樣品制備過程中量具、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基等外，主要表現(xiàn)為同一樣品同一人重復(fù)測定的檢測結(jié)果與同一組樣品平行測定的結(jié)果發(fā)散性較大，即發(fā)散是引起不確定度的主因，而B類不確定度占同一樣品重復(fù)性檢測所引起不確定度的24%，占一組樣品合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差引起不確定度的13%。由此可見，B類不確定度對乳酸菌檢測的合成不確定度的貢獻比最大分量的1/3還小，可忽略不計。因此，日常工作中只需要考慮重復(fù)檢測所引入的不確定度。與此同時，為節(jié)省時間、降低成本，當(dāng)樣品檢測結(jié)果發(fā)散性很大時，可采用合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差求檢驗結(jié)果的不確定度，根據(jù)每次新積累的實驗數(shù)據(jù)，重新計算合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差，更新不確定度的取值范圍。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB4789.35-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[2]謝繼志，肖宏彬.酸奶中乳酸菌數(shù)及酸度的檢測與評價[J].中國乳品業(yè)，2002，30（1）：22-25.

[3]全國認(rèn)證認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.GB/T27025-2008檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[4]全國認(rèn)證認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.ISO/IEC17025-2005中國實驗室國家認(rèn)可委員會檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

[5]中國認(rèn)證認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.CNAS-CL09-2013檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[6]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJF1056.1-2012測量不確定度評定與表示[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[7]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T4091-2015食品微生物學(xué)測量不確定度評估指南[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

[8]李玉玲，宋莉莉.食品微生物學(xué)菌落總數(shù)檢驗中不確定度的評定[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（7）：880-896.

[9]楊 燕，李瓊瓊，宋光艷，等.能力驗證乳粉中乳酸菌計數(shù)不確定度的評定[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2016，7（7）：2747-2750.

[10]李 莎，譚 震.酸乳乳酸菌數(shù)檢驗中不確定度的評定[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志2012，22（8）：1864-1865.

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[12]王海華，蘭 茜.能力驗證菌落總數(shù)測定結(jié)果不確定度的評定[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，6（6）：2354-2355.

[13]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJG196-2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2006.