草菇菌絲培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

◎ 李淑嫻

（佛山市高明區(qū)荷城民旺豆制品加工廠，廣東 佛山 528511）

草菇營養(yǎng)豐富，味道鮮美。每100 g鮮菇含207.7 mg維生素C，2.6 g糖分，2.68 g粗蛋白，2.24 g脂肪，0.91 g灰分。草菇蛋白質含18種氨基酸，其中必需氨基酸占40.47%～44.47%[1]。此外，還含有磷、鉀、鈣等多種礦質元素，是國際公認的“十分好的蛋白質來源”，并有“素中之葷”的美名，是世界上第三大栽培食用菌[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與儀器設備

菌株：草菇（Volvariella volvacea）菌株由佛山科學技術學院食品科學實驗室保存。

儀器設備：手提式壓力蒸汽滅菌器，YXQ-SG46-280S，上海博迅實業(yè)有限公司；電子天平，MP400，上海第二天平儀器廠；微波爐，WP700機械型，廣東格蘭仕集團有限公司；霉菌培養(yǎng)箱，MTX-250B-Z型，上海博迅實業(yè)有限公司；超凈工作臺，SW-CJ-IBU，上海博迅實業(yè)有限公司；酒精燈、接菌種針、培養(yǎng)皿、燒杯、滴管、試管、錐形瓶。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

PDA培養(yǎng)基（基本培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮）200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000.0 mL。

1.1.3 供試碳源

分別選擇供試碳源（質量分數各為2.0%）：蔗糖、果糖、麥芽糖和玉米粉替代PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖（CK）作培菌試驗，pH自然。

1.1.4 供試氮源

以PDA為基本培養(yǎng)基，分別添加蛋白胨、酵母粉、硝酸銨和氯酸銨培菌。

1.1.5 供試無機鹽

以PDA為基本培養(yǎng)基，分別添加大量元素（添加質量濃度各為1.0 g/L）KH2PO4、MgSO4和KNO3作培菌試驗，并以普通PDA（不添加）作CK。

以PDA為基本培養(yǎng)基，分別添加微量元素（添加質量濃度各為3.0 mg/L）：CuSO4、FeSO4和ZnSO4作培菌試驗，并以基本PDA（不添加）作CK。

1.2 方法

1.2.1 營養(yǎng)單因子試驗

初步在CK平板上培養(yǎng)蘑菇菌絲，沿菌落邊緣切割直徑為5.0 mm的菌塊，接種于不同碳源、氮源、無機鹽（大量營養(yǎng)元素和微量元素）等平板培養(yǎng)基中，置于（30±0.5）℃恒溫培養(yǎng)，任何時候加工菌絲生長培養(yǎng)皿終菌，定期觀察。每次治療重復3次。菌絲生長速度（mm/d）=菌落半徑（mm）÷菌絲生長天數（d）[3]。

1.2.2 pH值試驗

培養(yǎng)基滅菌前，調節(jié)為 4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、11.0共6個pH值梯度進行培菌試驗，每個處理3次重復，方法同營養(yǎng)單因子試驗。

1.2.3 溫度試驗

將接種于PDA培養(yǎng)基上的菌塊置于20、25、30、35、40 ℃共5個溫度梯度進行培菌試驗，每個處理3次重復，方法同營養(yǎng)單因子試驗。

1.2.4 營養(yǎng)因子正交試驗

根據以上單因子試驗結果，以菌株和最佳的碳源（A）、氮源（B）、大量元素（C）和微量元素（D）等作為營養(yǎng)因子，采用4因子3水平正交表L9（34）設計培養(yǎng)基配方試驗[4]，每個處理3次重復，分別測定菌絲長速和菌絲長勢。

2 結果與分析

2.1 碳源對草菇菌絲生長的影響

對5種不同碳源培養(yǎng)基進行了菌絲生長速度和生長勢測定，由表1可知，草菇菌絲對參試的4種碳源均能利用，菌絲生長速度的順序為蔗糖（6.68 mm/d）＞葡萄糖（6.15 mm/d）＞果糖（6.13 mm/d）＞麥芽糖（5.62 mm/d）＞玉米粉（5.00 mm/d）。最佳碳源為蔗糖，比其他因素培菌的差異極顯著。果糖、葡萄糖與麥芽糖、玉米粉培菌的差異極顯著，玉米粉與麥芽糖培菌差異極顯著。菌絲對玉米粉的利用率最差，表現為長速最慢、長勢最弱。

表1 碳源對草菇菌絲生長的影響表

2.2 氮源對草菇菌絲生長的影響

以4種不同氮源培養(yǎng)基進行了平板上菌絲生長速度和生長勢測定。表2表明，4種不同氮源培養(yǎng)基都能被草菇菌絲利用，菌絲生長速度的順序為蛋白胨＞酵母粉＞硝酸銨＞氯酸銨，最佳氮源為蛋白胨，菌絲長速達6.93 mm/d，比酵母粉培菌的長速差異顯著。硝酸銨與酵母粉培菌差異不顯著，硝酸銨、酵母粉與氯酸銨差異極顯著。

表2 氮源對草菇菌絲生長的影響表

2.3 無機鹽（大量元素）對草菇菌絲生長的影響

在培養(yǎng)基中添加無機鹽（大量元素）進行平板上菌對絲生長速度和生長勢的測定。結果表明，硫酸鎂＞磷酸二氫鉀＞CK＞硝酸鉀，即添加的無機鹽中硫酸鎂促進菌絲生長的效果最好，硫酸鎂與磷酸二氫鉀培菌效果差異顯著，硫酸鎂、磷酸二氫鉀與CK培菌差異極顯著，CK與硝酸鉀培菌差異不顯著。與CK相比，添加硫酸鎂、磷酸二氫鉀促進菌絲生長效果明顯，而添加硝酸鉀對于菌絲生長的促進效果不明顯，甚至可能對菌絲生長造成不利影響，見表3。

表3 大量元素對草菇菌絲生長的影響表

2.4 無機鹽（微量元素）對草菇菌絲生長的影響

以4種不同微量元素培養(yǎng)基進行了平板上菌絲生長速度和生長勢測定。由表4可知，硫酸亞鐵＞硫酸鋅＞CK＞硫酸銅，即說明微量元素能促進菌絲生長。試驗菌株發(fā)酵硫酸亞鐵菌生長速度快。最好的微量元素是硫酸亞鐵。菌絲體高速生長6.47 mm/d，比對照組高8.74%，與硫酸鋅和硫酸銅明顯不同。

表4 微量元素對草菇菌絲生長的影響表

2.5 pH對草菇菌絲生長的影響

試驗結果表明，草菇菌絲生長適宜的pH值范圍較廣，由表5可知，草菇菌絲在pH 7.0～10.0范圍內生長良好，在pH大于10.0的情況下，菌絲還能較快生長，而pH值低于7.0以后，pH越低，菌絲生長速度越慢，長勢越差，可見草菇菌絲適宜在中性偏堿的環(huán)境中生長。堿性環(huán)境不利于細菌的生長，因此在菌絲培養(yǎng)時可以適當增加pH，以減少雜菌的污染，促進草菇菌絲的生長，提高草菇菌絲的營養(yǎng)利用率。

表5 pH值對草菇菌絲生長的影響表

2.6 溫度對草菇菌絲的影響

溫度是影響香菇菌絲生長的重要因素。對此，進行了不同溫度下培養(yǎng)皿生長的試驗，結果見表6。香菇菌絲生長在40 ℃時不生長，35 ℃和30 ℃時菌絲生長最好，25、20 ℃時，菌絲依次減速，菌絲體削弱。35、30 ℃時培菌差異不顯著，35、30 ℃培菌與25、20 ℃差異極顯著，20 ℃與35、30、25 ℃培菌差異極顯著。

表6 溫度對草菇菌絲生長的影響表

2.7 優(yōu)化營養(yǎng)因子的確定

為了找出草菇菌絲生長培養(yǎng)基的優(yōu)化組合，選取對草菇菌絲生長影響比較大的4個重要營養(yǎng)因子，即碳源（蔗糖）、氮源（蛋白胨）、大量元素（硫酸鎂）和微量元素（硫酸亞鐵），采用L9（34）正交表設計4因子3水平的培養(yǎng)基配方正交試驗[6]，試驗設計及結果見表7。

表7 優(yōu)化營養(yǎng)因子正交試驗結果及分析表

通過極差分析表明，蔗糖、蛋白胨、硫酸鎂和硫酸亞鐵4個培養(yǎng)基營養(yǎng)因子中，對草菇菌絲生長影響主次順序為B＞A＞C＞D，即蛋白胨＞蔗糖＞硫酸鎂＞硫酸亞鐵，草菇最佳培養(yǎng)因子組分：4.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L蔗糖、1.5 g/L硫酸鎂、3.0 mg/L硫酸亞鐵，最優(yōu)組合為B3A1C2D2。據正交試驗最佳營養(yǎng)組合條件進行驗證試驗，菌絲平均長速達8.23 mm/d，優(yōu)于正交試驗的任一組合，證明正交試驗最佳培養(yǎng)組合條件是可靠的。

3 討論

碳源是草菇重要的營養(yǎng)來源，氮源是草菇蛋白質和核酸合成的必需原料。一般來說，草菇在營養(yǎng)生殖生長階段，氮的主要來源是蛋白質、氨基酸、尿素、氨、銨鹽和硝酸鹽。在草菇的生長發(fā)育中還需要一定的無機鹽類，這些無機鹽中的金屬元素磷、鉀、鎂最為重要。

pH值是影響草菇新陳代謝的重要因素，pH值的高低直接影響微生物細胞的新陳代謝，影響整個微生物的生命活動?；|中酸堿度的適合與否，首先關系酶的活性。酸堿度適宜，生理活動就正常，草菇的生長發(fā)育就順利、旺盛；反之，生理活動就受到阻礙，甚至引起死亡。

草菇的生長繁殖都在一定的溫度下進行。溫度適宜，其生命活動旺盛。超過或低于適溫，其活力減退或緩慢。

通過單因子試驗和正交試驗，研究了碳源、氮源、無機鹽（大量元素、微量元素）、溫度和酸堿度對草菇菌絲生長的影響。結果表明，菌絲生長最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，最佳無機鹽為硫酸鎂，最佳微量元素為硫酸亞鐵，最適培養(yǎng)溫度為30～35 ℃，最適pH值范圍為7.0～10.0。正交試驗確定最佳培養(yǎng)基組分為蔗糖20.0 g/L、蛋白胨4.0 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、硫酸亞鐵3.0 g/L、馬鈴薯200 g/L。草菇菌絲最適宜生長溫度為30 ℃，pH值為7.0～10.0。在此優(yōu)化的栽培條件下，草菇菌絲生長速度達8.23 mm/d。對比參考文獻，本研究的營養(yǎng)因子促進菌絲生長結果：草菇菌絲在有機氮源培養(yǎng)基上的生長速度要優(yōu)于無機氮源，其中以蛋白胨為氮源的菌絲長速最快，長勢最強，接近或優(yōu)于相關文獻報道的參數[7-8]，但在研究pH對草菇菌絲生長影響的單因素試驗中，本研究得出當pH等于11時，草菇菌絲長速與pH 7.0～10.0時差異顯著，與部分參考文獻所得的最優(yōu)pH 7.0～11.0略有差異。在正交試驗中，得出最主要營養(yǎng)因素為氮源，與部分參考文獻中的最主要營養(yǎng)因素為碳源有差異?？赡苁且驗樗x用的草菇菌種不同，相應最適宜的pH和最主要的營養(yǎng)因素有所差異。

4 小結

4.1 優(yōu)質碳源可促進草菇菌絲生長

草菇菌絲生長的優(yōu)質碳源為蔗糖，菌絲長速試驗的草菇菌株對不同碳源影響菌絲生長的差異，表明最佳碳源為蔗糖，菌絲長速平均達6.68 mm/d，比CK提高7.82%，果糖次之，玉米粉最差。

4.2 蛋白胨是草菇菌絲生長的優(yōu)良氮源

不同氮源對菌絲生長影響結果：最佳氮源為蛋白胨，酵母粉次之，表現為菌絲長勢強、長速快；氯酸銨最差，表現為菌絲長勢弱、長速慢。表明有機氮源對菌絲的促進作用優(yōu)于無機氮源。

4.3 草菇菌絲生長的最佳無機鹽是硫酸鎂和硫酸亞鐵

添加無機鹽（MgSO4、KH2PO4）促進菌絲生長效果明顯，最佳大量元素為MgSO4。不同微量元素對菌絲生長速度和生長勢影響不同，以硫酸亞鐵培菌的菌絲長勢強、長速快。最佳微量元素為硫酸亞鐵，硫酸鋅次之，硫酸銅最次。

4.4 草菇菌絲生長的pH范圍廣且喜好偏堿性生長環(huán)境

試驗結果表明，菌株在pH 7.0～10.0生長良好，草菇菌絲生長適宜的pH值范圍較廣，最佳pH為8。pH超過10，菌絲還可以較快地生長。因此，在制種和栽培期間可適當提高培養(yǎng)基質的pH值，以減少雜菌的污染與減少殺菌劑的使用[9]，有利于生產無公害蔬菜[10]。

4.5 草菇屬于高溫型草菇，菌絲生長喜高溫

繪制溫度對菌絲體生長的影響曲線圖，結果表明，菌絲生長在40 ℃時不生長，在35 ℃和30 ℃條件下菌絲生長最好，菌絲生長最快，25、20 ℃時，菌絲依次減速，菌絲體削弱。

4.6 經過試驗確定了草菇菌絲最佳培養(yǎng)因子組分

正交試驗結果顯示，4株菌株的菌絲生長長期差異有顯著意義，其次為蛋白胨＞蔗糖＞硫酸鎂＞硫酸亞鐵。營養(yǎng)因子促進菌絲生長結果：菌株菌絲生長速度快，影響試驗表明，蔗糖的最佳氮源為蛋白胨，最佳無機鹽為硫酸鎂，最佳微量元素為硫酸亞鐵，適宜pH 7.0～10.0，培養(yǎng)溫度30～35 ℃。最佳培養(yǎng)基組分為蔗糖20.0 g/L，蛋白胨4.0 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，硫酸亞鐵3.0 mg/L，馬鈴薯200.0 g/L。在最佳培養(yǎng)條件下菌絲生長速率為8.23 mm/d。

[1]李克宜.鮮美菌品——草菇[M].南寧：廣西科學技術出版社，2004.

[2]曹玉佩.草菇增產增收的四項措施[J].山東蔬菜，2008（2）：47.

[3]伍國明.酵母浸膏蛋白胨對草菇培養(yǎng)與生物學效率的影響[J].中國草菇，2009，28（1）：27-29.

[4]唐啟義，馮明光.實用統(tǒng)計分析及其DPS數據處理系統(tǒng)[M].北京：科學出版社，2002.

[5]羿 紅，謝福泉，鄭 俊，等.草菇周年栽培關鍵技術研究——草菇稻草熟料周年栽培菌株篩選[J].草菇學報，2007，14（1）：10-14.

[6]伍國明，李 梅.營養(yǎng)及培養(yǎng)溫度對草菇菌絲生長的影響[J].中國草菇，2009（3）：8-9.

[7]王欽德，楊 堅.食品實驗設計與統(tǒng)計分析[M].北京：中國農業(yè)大學出版社，2003.

[8]伍國明，李 梅.草菇菌絲優(yōu)化培養(yǎng)條件的研究[J].中國草菇，2009，28（3）：28-31.

[9]張金霞.草菇安全優(yōu)質生產技術[M].北京：中國農業(yè)出版社，2006.

[10]伍國明.微波處理與涂膜對草菇控溫貯藏保鮮的影響研究[J].草菇學報，2009，16（2）：45-50.