食品微生物檢查法菌懸液保存時間的探討

◎ 彭會娟

（撫州市食品藥品檢驗所，江西 撫州 344000）

食品安全是人們一直關(guān)注的問題，食品微生物也就成為研究的重點。食品微生物檢查中，菌懸液保存至關(guān)重要，保存方式如果出現(xiàn)問題，將會導(dǎo)致實驗研究出現(xiàn)很大的誤差。實驗研究表明，菌微生物生長狀態(tài)對于食品供試品檢驗的手段及結(jié)果等具有直觀的影響，因此應(yīng)嚴(yán)格控制保存時間。

1 食品微生物

我們的生活離不開食物，食物中包含各種類型的微生物，科學(xué)家將這方面的研究稱之為食品微生物學(xué)。食品微生物學(xué)包含醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及工業(yè)等多方面，微生物學(xué)中將食品單獨列為一種，屬于單獨的研究科學(xué)項目之一。食品微生物的類型主要有3種：①用于食品加工的微生物。通過食品微生物的作用，制造生產(chǎn)各種類型的飲料、醬油、酒、醋等，還包含味精。當(dāng)然，一些面食，如饅頭或者面包等，都屬于發(fā)酵食品，需要微生物的支持才能實現(xiàn)。②因食物變質(zhì)而產(chǎn)生的微生物。生活中一些食物因為放置時間較長或者溫度較高出現(xiàn)變質(zhì)，這些變質(zhì)的食物中包含非常多的微生物。③食源性病原微生物。含有這種類型的微生物的食物如果被人們食用，將會引發(fā)食物中毒現(xiàn)象，使人的頭腦意識不清晰，或者感染各種傳染病等。當(dāng)然，不僅是人類，動物、植物等都會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。因此，對食品微生物應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)實驗，為各行各業(yè)貢獻(xiàn)作貢獻(xiàn)。當(dāng)然，食品微生物檢查法菌懸液保存時間是實驗中比較難控制的一部分，需要通過仔細(xì)的探索研究，保證不會影響最終的實驗結(jié)果[1]。

2 材料與方法

2.1 實驗儀器設(shè)備

選擇恒溫干燥的環(huán)境，準(zhǔn)備生化培養(yǎng)箱，還需要準(zhǔn)備滅菌器（立式壓力蒸汽型），霉菌培養(yǎng)箱。

2.2 實驗食品微生物菌種

本文主要選擇大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，綠膿桿菌[CMCC（B）39094]，白假絲酵母菌[CMCC（F）98001]。以這些菌類為研究基礎(chǔ)，材料基本都是從A省微生物研究所菌種保藏中心購買得來，都屬于冷凍干燥菌種。結(jié)合實驗研究規(guī)定，主要用途為復(fù)蘇、保藏、使用、傳代，實驗所應(yīng)用的菌株其傳代次數(shù)都不能超出5代。

2.3 培養(yǎng)基介紹

培養(yǎng)基主要選擇胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。幾種培養(yǎng)基的來源均為B生物制品有限公司，購進(jìn)條件符合相關(guān)規(guī)定要求，購進(jìn)價格合理，均在有效期之內(nèi)，有詳細(xì)的使用說明書，要求必須按照使用說明進(jìn)行配制應(yīng)用[2]。

2.4 具體實驗方法

對于食物微生物檢測以及法菌懸液保存時間等的實驗研究，全部需要按照我國《中國藥典》（2015版）相關(guān)附錄規(guī)定，其中針對實驗方法提出“微生物限度檢查法”“無菌檢查法”，根據(jù)這兩個方法進(jìn)行實驗操作，實驗原材料一定要保證新鮮，必須選擇新鮮的培養(yǎng)物或者胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基對實驗微生物進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為18～24 h[3]。上述介紹的培養(yǎng)物，由氯化鈉（0.9%）注射液制作而成，得到0.5麥?zhǔn)蠁挝粷舛戎?，將菌懸液進(jìn)行稀釋，稀疏度為10-5～10-7，并且菌液必須均勻劃分成兩份，一份放置到正常室溫中，一份放置到冰箱中，冰箱溫度調(diào)整為2～8 ℃。采用活菌平皿計數(shù)法的形式，對微生物中的每株菌懸液都進(jìn)行平行處理，將其放置到兩個平皿中，預(yù)留制備。不同菌類溫度時間都存在明顯區(qū)別。比如，大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌，放置于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)觀察，溫度控制在35 ℃，時間為48 h。白假絲酵母菌需要傾注到沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)觀察，溫度控制在28 ℃，時間為72 h。

3 食品微生物檢查法菌懸液保存時間實驗結(jié)果

3.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

結(jié)合上述實驗注意細(xì)節(jié)，實驗時間以及菌類放置等方面的介紹，開始實驗，同時及時記錄實驗數(shù)據(jù)，為了方便審閱，將其制作成表格，見表1。

表1 各類菌懸液含菌數(shù)表

需要注意的是，當(dāng)下菌類研究中，都是放置于室內(nèi)、冰箱兩種不同的溫度環(huán)境下，時間不斷變化，菌數(shù)也在不斷變化。表1中的數(shù)據(jù)都是為3次均值。結(jié)合具體實驗數(shù)據(jù)，對表1進(jìn)行詳細(xì)分析，總結(jié)出最佳保存時間。

3.2 實驗結(jié)果

實驗結(jié)束之后，需要對其進(jìn)行詳細(xì)的討論分析。食品微生物檢查期間，根據(jù)《中國藥典》，結(jié)合其中對陽性對照菌的規(guī)定等進(jìn)行研究，知道需要陽性對照菌1 mL含菌量能夠達(dá)到50～100 CFU，細(xì)菌、酵母菌等菌懸液其需要放置到室溫中，必須保證在24 h內(nèi)使用。此次試驗中，主要選擇平皿計數(shù)法的方式進(jìn)行計算，對不同時間段內(nèi)的陽性菌進(jìn)行計數(shù)，在這個過程中可以非常直觀地顯現(xiàn)出菌懸液在生物、化學(xué)等方面研究中的適用性。并且，根據(jù)實驗研究可以發(fā)現(xiàn)，選擇的5種菌懸液，分別控制在室溫為22～25 ℃、（4±1）℃不同時間之后，含菌數(shù)會出現(xiàn)巨大的變化，當(dāng)然，時間不同，變化程度也不相同。大部分都是隨著時間放置的延長，細(xì)菌生存率越小，下降趨勢如圖1所示。

圖1 時間、細(xì)菌變化圖

圖1中，A、B、C、D、E分別代表5種微生物菌類變化點，L、L1、L2、L3、L4分別表示時間變化，隨著時間的延長，菌類數(shù)量逐漸遞減。5種菌懸液在室溫情況下，保存時間2 h以內(nèi)，菌落數(shù)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)實驗要求。低溫情況下菌懸液的保存，如大腸埃希菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌，配制好之后要在24 h之內(nèi)使用，但是白假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌卻需要在使用的時候新配，或者低溫存儲，保證12 h之內(nèi)使用。

《中國藥典》中明確規(guī)定，1 mL的菌懸液，含菌量為50～100 CFU，制備期間，會為實驗人員帶來很多不必要的麻煩，并且實驗研究中，操作過程繁瑣，非常消耗時間，工作量極大，保證菌懸液含菌數(shù)50～100 CFU，但是中間很多環(huán)節(jié)都會導(dǎo)致誤差。關(guān)于這方面，相關(guān)研究部門一直在深入研究，將菌懸液含菌數(shù)量級調(diào)整到0.5麥?zhǔn)蠁挝唬瑫r結(jié)合菌體大小，對菌懸液進(jìn)行稀釋。一般情況下，細(xì)菌稀釋都是10-5～10-7級別，真菌的稀釋一般為10-4～10-5級別，這樣稀釋之后，就可以保證1 mL的菌懸液其含菌數(shù)為50～100 CFU，實驗菌液實驗結(jié)果準(zhǔn)確度也得到提升，同時可減少相關(guān)工作人員的工作量，減小整體實驗檢驗誤差。從整個實驗研究中總結(jié)經(jīng)驗，為我國生物制藥企業(yè)、化學(xué)研究企業(yè)等的相關(guān)研究開創(chuàng)了更多的途徑，并且微生物檢驗工作人員有了更加標(biāo)準(zhǔn)的參考依據(jù)，檢驗方式也變得多樣。

4 實驗展望

當(dāng)下，科學(xué)技術(shù)、生物研究手段等得到迅速發(fā)展，微生物研究也取得了非常大的成就。尤其是食品質(zhì)量方面，人們對其的要求不斷增加，食品中微生物菌懸液保存時間至關(guān)重要。微生物菌懸液保存時間進(jìn)行研究，獲得了客觀的收獲，這些發(fā)展與收獲，可提高食品微生物研究準(zhǔn)確性，減小數(shù)值誤差，為微生物研究發(fā)展提供堅強(qiáng)的后盾。

5 結(jié)語

食品微生物與人們的生活息息相關(guān)，控制好菌懸液保存時間，能夠提高食品微生物研究準(zhǔn)確性，為食品微生物的發(fā)展創(chuàng)造更多的機(jī)會。

[1]高 霞，嚴(yán)筱楠，高 娟，等.《中國藥典》2015年版與2010年版復(fù)方青黛膠囊微生物限度檢查法的驗證研究[J].藥物生物技術(shù)，2017（5）：402-405.

[2]羅 潔，梁 雪，黃 琰.血液制品中間樣品的微生物限度檢查待檢有效期探討[J].生物技術(shù)世界，2015（11）：285-286.

[3]黃 結(jié)，韋 濤.3種稀釋液制備的菌懸液存活時限比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2015，25（12）：1948-1951.