β-半乳糖苷酶的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展

董藝凝， 陳海琴， 張 灝， 陳 衛(wèi)

（1.滁州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）全稱為 β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶 （β-D-galactoside galacto hydrolase，EC3.2.1.23），具有催化乳糖水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種功能[1]。特別是利用其轉(zhuǎn)糖苷作用合成低聚半乳糖（Galacto-oligosaccharides，GOS），已逐漸成為近年來功能性低聚糖開發(fā)與技術(shù)應(yīng)用的新熱點(diǎn)[2]。與其他人們較為熟知的功能性低聚糖，如低聚果糖（Fructo-oligosaccharide，F(xiàn)OS）和低聚異麥芽糖（Isomatto-oligosaccharide，IMO）等相比，低聚半乳糖是唯一能夠被人體全部腸道益生菌利用的真正益生元。特別是母乳中所含低聚半乳糖（Human milk oligosaccharides，HMO）是形成嬰兒初期腸道益生菌類型的關(guān)鍵因子。由于母乳來源的低聚半乳糖（HMO）結(jié)構(gòu)復(fù)雜且數(shù)量有限，因此通過酶法合成GOS已成為HMO的主要替代品。目前的全球消費(fèi)量在20 000 t/年左右，并以每年10%～20%的比例增長[3]。

但是，β-半乳糖苷酶普遍轉(zhuǎn)糖苷活性低，并且由于底物水解反應(yīng)的同時(shí)存在，導(dǎo)致產(chǎn)物往往包括多樣化糖苷聚合度及糖苷鍵構(gòu)成類型，并最終限制了GOS合成量和純度。我國對β-半乳糖苷酶催化合成GOS的研究起步相對較晚，目前生產(chǎn)中所需β-半乳糖苷酶的來源仍以進(jìn)口為主[4-5]。自2008年批準(zhǔn)GOS作為新資源食品以來，國內(nèi)具有產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的僅限于少數(shù)幾家企業(yè)，如廣東江門量子高科生物工程有限公司與廣東云浮市新金山生物科技有限公司。而高純度GOS產(chǎn)品的生產(chǎn)在我國還處于空白階段。如何改造并調(diào)控β-半乳糖苷酶的催化反應(yīng)以解決GOS合成產(chǎn)量及及優(yōu)化產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)是目前β-半乳糖苷酶功能開發(fā)與應(yīng)用的共性技術(shù)問題。

針對行業(yè)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，只有對β-半乳糖苷酶催化機(jī)理及產(chǎn)物形成機(jī)制開展深入的研究探索，才能有望從反應(yīng)調(diào)控與功能優(yōu)化角度有效解決GOS產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)問題。作者針對近十年相關(guān)研究過程中所積累下的大量酶學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué)及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)成果，從β-半乳糖苷酶的分類、催化機(jī)制理論、結(jié)構(gòu)及特殊催化功能開發(fā)幾個(gè)方面對β-半乳糖苷酶的理論與應(yīng)用研究現(xiàn)狀與進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為β-半乳糖苷酶催化機(jī)理的深入研究與功能調(diào)控提供參考。

1 β-半乳糖苷酶家族分化及催化機(jī)制形成

酶的分子改造與功能開發(fā)需要有深入的催化機(jī)理研究和豐富的基因進(jìn)化信息作為基礎(chǔ)。1991年，Henrissat第一次根據(jù)氨基酸序列相似性對糖苷水解酶進(jìn)行分類[6]，到目前為止，已由最初的35個(gè)家族發(fā)展成135個(gè)，分屬于14個(gè)（GH-A～GH-N）糖苷水解酶超家族 （http：//www.cazy.org/）。基于氨基酸序列相似性進(jìn)行分類的方法可以使不同底物特異性的糖苷水解酶聚類為同一家族，如GH-1，GH-13，GH-16家族都含有不同底物特異性的成員。同樣，具有相同底物特異性的糖苷水解酶也可能分屬于不同的家族，如纖維素酶就分屬于11個(gè)不同的家族。但對于β-半乳糖苷酶的家族分布及其催化機(jī)制的形成特點(diǎn)目前尚無系統(tǒng)的分析與總結(jié)。

1.1 β-半乳糖苷酶家族分化

β-半乳糖苷酶可以水解β-1，4-糖苷鍵，屬糖苷水解酶類（Glycoside Hydrolases，GH），并在進(jìn)化過程中演變形成多樣的底物特異性。依據(jù)蛋白質(zhì)序列相似分類，β-半乳糖苷酶分別屬于糖苷水解酶家族GH-1，GH-2，GH-35和 GH-42， 并在這些家族分布中顯現(xiàn)出不同的催化及結(jié)構(gòu)特征。如，GH-1，GH-2和GH-35家族除了β-半乳糖苷酶還包括其它糖苷水解酶類，只有GH-42家族所有成員都為β-半乳糖苷酶，而GH-2家族的β-半乳糖苷酶通常在糖苷水解和轉(zhuǎn)糖苷兩方面都表現(xiàn)出較高的活性。 還有研究表明，GH-1，GH-2，GH-5，GH-10，GH-17，GH-30，GH-35，GH-39 以及 GH-42 家族是由共同的祖先分子進(jìn)化而來[7-8]。雖然，不同家族的糖苷水解酶的數(shù)量、酶學(xué)特征差別很大，但其催化構(gòu)象及機(jī)制在進(jìn)化過程中是卻是嚴(yán)格保守的。

1.2 β-半乳糖苷酶的催化機(jī)制研究

糖苷水解酶有兩種經(jīng)典的催化機(jī)制由Koshland在多年前提出并一直沿用至今，包括保持型（Retaining）機(jī)制和反轉(zhuǎn)型（Inverting）機(jī)制。這一理論主要基于糖苷水解酶在催化過程中會出現(xiàn)兩種不同的立體化學(xué)產(chǎn)物，即產(chǎn)物的異頭碳構(gòu)象與供體底物的相同或不同。保持型糖苷水解酶遵循兩步反應(yīng)的雙替換機(jī)制 （two-step double-displacement mechanism），包括糖基-酶復(fù)合物過渡態(tài)的形成和水解，每步反應(yīng)均通過酸堿催化完成（如圖1（a））。這個(gè)過程需要兩個(gè)含羧基的關(guān)鍵氨基酸參與，一個(gè)作為親核基團(tuán)攻擊底物異頭碳形成糖基-酶復(fù)合物；另一個(gè)羧基基團(tuán)作為酸堿催化劑，在第一步反應(yīng)中使羰基氧質(zhì)子化，第二步反應(yīng)中催化脫去一分子水。反轉(zhuǎn)型糖苷水解酶采用的是直接替換機(jī)制，活性位點(diǎn)為兩個(gè)含羧基氨基酸。一個(gè)羧基作為堿性基團(tuán)攻擊水分子，另一個(gè)羧基通過廣義的酸催化斷裂糖苷鍵。催化反應(yīng)通過一個(gè)類似氧代碳正離子過渡態(tài)實(shí)現(xiàn)（如圖1（b））。作為質(zhì)子供體的羧基氨基酸位置在兩種催化機(jī)制中保持一致，均位于能夠與糖苷氫鍵結(jié)合的距離范圍內(nèi)。但兩種催化機(jī)制堿性催化基團(tuán)的位置有所差別，其中保持型糖苷水解酶堿性基團(tuán)與糖基異頭碳的位置非常接近；而反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制中，因必須容納一個(gè)水分子在堿性基團(tuán)與糖基之間，使這一距離增大。這種差別造成兩種機(jī)制中關(guān)鍵催化殘基間距的不同，保持型催化機(jī)制兩個(gè)催化殘基距離約為5.5×10-10m，反轉(zhuǎn)型催化機(jī)制中兩者距離約為 9.5×10-10m[10]。

圖1 糖苷水解酶催化機(jī)制Fig.1 Glycosidases mechanisms

糖苷水解酶家族的結(jié)構(gòu)特征并不直接決定酶的立體化學(xué)催化特性，很多超家族中都同時(shí)具有保持型和反轉(zhuǎn)型糖基水解酶。但同一家族的水解酶往往具有相同的催化機(jī)制。目前，普遍認(rèn)為β-半乳糖苷酶采用的是保持型水解機(jī)制。催化過程如圖2所示。首先，底物分子需要與酶分子對接。當(dāng)?shù)孜锸侨樘菚r(shí)，糖基部分為半乳糖基，配糖體為葡糖基（如圖2中R1所代表）。β-半乳糖苷酶具有高度底物專一性，要求底物的半乳糖基必須與多糖部分以β-糖苷鍵連接。但對糖苷配基的要求不是很嚴(yán)格，因此R1所表示的配糖體部分甚至可以是低聚糖，此時(shí)反應(yīng)得到的產(chǎn)物即為低聚半乳糖（GOS）。早期研究表明β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)特征對底物與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合非常重要，研究報(bào)道主要集中在氫鍵、離子鍵及芳香族氨基酸側(cè)鏈對底物結(jié)合的影響等方面[11-12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，酶與底物結(jié)合模式，特別是結(jié)合位點(diǎn)氨基酸的類型與側(cè)鏈性質(zhì)對催化活性影響顯著[13-15]。其次，當(dāng)?shù)孜飳拥矫富钚晕稽c(diǎn)后，即與酶分子以共價(jià)鍵結(jié)合。隨即半乳糖基再被轉(zhuǎn)移到親核受體上。在這步反應(yīng)中，反應(yīng)會根據(jù)受體的不同而發(fā)生分歧。當(dāng)半乳糖基受體為水分子 （即圖中R2=H），反應(yīng)釋放出半乳糖。在此情況下，乳糖或低聚糖所發(fā)生的就是水解反應(yīng)，二糖或多糖被降解；當(dāng)受體為另一個(gè)多糖時(shí)，反應(yīng)就會朝向低聚半乳糖（GOS）合成的方向進(jìn)行，這種情況下發(fā)生的就是轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)。目前所有關(guān)于轉(zhuǎn)糖苷機(jī)制的研究報(bào)道，都是基于對糖苷水解反應(yīng)做出的推測。尚不清楚當(dāng)受體不同時(shí)（比如糖類或水），β-半乳糖苷酶的水解活性是否發(fā)生改變。但是，不同β-半乳糖苷酶對水和糖類的選擇特異性有差別，即使催化作用相同，不同酶的催化能力及產(chǎn)物 （水解及轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物）組成均不相同[16-17]。也有研究表明，β-半乳糖苷酶的底物特異性與活性位點(diǎn)氨基酸模塊（motif）有關(guān)[18]。

2 微生物來源β-半乳糖苷酶的催化特性及研究概況

許多生物自身可以合成β-半乳糖苷酶，包括微生物、植物及動物細(xì)胞[2]。這些不同來源的β-半乳糖苷酶在酶學(xué)特征上存在較大差異，只有對其酶學(xué)特性有所認(rèn)識和比較，才能更好的開發(fā)適合工業(yè)應(yīng)用的生物催化劑。通過家族間β-半乳糖苷酶來源的比較分析發(fā)現(xiàn)，微生物來源β-半乳糖苷酶的數(shù)量最為豐富。因此，作者總結(jié)并分析了主要微生物來源β-半乳糖苷酶的催化特性及其在基因工程方面的研究進(jìn)展。

圖2 β-半乳糖苷酶反應(yīng)機(jī)制[11]Fig.2 Reaction mechanism for β-galactosidase

2.1 β-半乳糖苷酶的微生物來源

目前，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的是來自霉菌（Aspergillus spp.）和克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces spp.）的β-半乳糖苷酶。這兩種微生物可以較容易的通過培養(yǎng)獲得可觀的生產(chǎn)能力及產(chǎn)量。且霉菌和乳酸克魯維酵母來源產(chǎn)物被公認(rèn)為具有食品安全性（GRAS），這一點(diǎn)對食品消費(fèi)至關(guān)重要[19]。霉菌屬來源β-半乳糖苷酶是胞外酶，最適pH在酸性范圍內(nèi)（2.5～5.4），最適作用溫度最高可達(dá)50℃，主要被應(yīng)用于水解酸性pH條件的乳清[20]。相反，克魯維酵母菌屬來源β-半乳糖苷酶是胞內(nèi)酶，乳糖需要先通過透性酶轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)再被水解代謝[21]。酵母來源的β-半乳糖苷酶最適作用pH接近中性（6.0～7.0），因而有比較廣泛的應(yīng)用，尤其用于牛乳及乳清中乳糖的水解。商業(yè)化β-半乳糖苷酶主要包括乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）和馬克斯克魯維酵母 （Kluyveromyces marxiamus）（根據(jù)目前的分類還包括 Kluyveromycesfragilis和Saccharomycesfragilis及其變形體 Candida pseudotropicalis）； 霉菌屬有黑曲霉（Aspergillus niger）和米曲霉（Aspergillus oryzae）。另外，大腸桿菌（Escherichia coli）來源β-半乳糖苷酶作為模式酶，研究最為廣泛并被商業(yè)化生產(chǎn)，但因其不屬于食品安全級產(chǎn)物（GRAS），而被主要用于生化分析領(lǐng)域。除此之外，已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化上產(chǎn)的還有桿菌屬（Bacillus sp.）來源的 β-半乳糖苷酶。

2.2 β-半乳糖苷酶的基因工程研究現(xiàn)狀

除了在自然界不斷發(fā)掘具有新特性的酶，對于一些在來源微生物中表達(dá)量較低的β-半乳糖苷酶，可以通過DNA重組技術(shù)對其進(jìn)行外源表達(dá)以提高產(chǎn)量，從而擴(kuò)展其應(yīng)用范圍及在工業(yè)生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。同時(shí)，現(xiàn)代分子生物技術(shù)結(jié)合生物工程策略對酶的生產(chǎn)優(yōu)化與功能改造，形成了具有經(jīng)濟(jì)、技術(shù)效益的酶生產(chǎn)體系。目前，針對β-半乳糖苷酶的生物工程改造主要包括酶的重組表達(dá)、轉(zhuǎn)糖苷活性調(diào)控、胞外分泌改造及底物抑制作用優(yōu)化等幾個(gè)方面[22-25]。近年來，快速發(fā)展的晶體結(jié)構(gòu)研究與數(shù)據(jù)積累也為β-半乳糖苷酶的功能改造奠定了基礎(chǔ)。作者將微生物來源的β-半乳糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)匯總?cè)绫?。截止2000年，β-半乳糖苷還僅有8個(gè)酶晶體結(jié)構(gòu)報(bào)道[26]。但時(shí)間發(fā)展到2010-2015期間，研究報(bào)道迅速累積到103例道。目前，β-半乳糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)達(dá)到190個(gè)，但用于食品工業(yè)生產(chǎn)中的β-半乳糖苷酶還沒有結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的研究報(bào)道。相對于快速開發(fā)的食品用β-半乳糖苷酶，其結(jié)構(gòu)機(jī)制方面的研究明顯不足。

表1 β-半乳糖苷酶晶體結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的收錄匯總Table 1 β-Galactosidases with crystalstructures deposited in the Protein Data Bank

3 耐熱β-半乳糖苷酶的應(yīng)用優(yōu)勢

β-半乳糖苷酶雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化，但是其應(yīng)用仍受到熱穩(wěn)定及產(chǎn)物抑制等問題的限制。因此，開發(fā)不同來源、具有特殊催化功能的β-半乳糖苷酶一直是工業(yè)化生產(chǎn)的一項(xiàng)需求。目前β-半乳糖苷酶開發(fā)的主要方向包括：一是酵母和細(xì)菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶及具有低溫活性的酶；二是乳酸菌（包括 lactococci，streptococci和 lactobacilli） 及雙歧桿菌等被認(rèn)定為食用安全微生物來源的食品級β-半乳糖苷酶，以應(yīng)用于功能性食品的開發(fā)。特別是耐熱β-半乳糖苷酶一直在乳品生產(chǎn)領(lǐng)域備受關(guān)注。由于高溫反應(yīng)條件具有獨(dú)特的生產(chǎn)應(yīng)用優(yōu)勢，包括提高底物溶解度，獲得較高的乳糖初濃度；降低水解產(chǎn)物對酶活的抑制作用；增大反應(yīng)速率；進(jìn)而延長生產(chǎn)過程中酶的半衰期；降低微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)等。因此，相對于常溫及低溫β-半乳糖苷酶，耐熱β-半乳糖苷酶具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

目前，以嗜熱原核微生物及其耐熱酶的研究最為系統(tǒng)。有關(guān)耐熱β-半乳糖苷酶的來源及性質(zhì)已有大量研究報(bào)道[20，27-29]。耐熱β-半乳糖苷酶多來源硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus）和激烈火球菌（Pyrococcus furiosus），以及一些高溫菌和中溫細(xì)菌，如耐熱嫌氣菌、棲熱菌、嗜熱菌和古細(xì)菌等。其中，嗜熱細(xì)菌是耐熱β-半乳糖苷酶的一個(gè)重要來源，嗜熱細(xì)菌生長溫度一般在55～65℃，酶最適溫度55～70℃。如嗜熱鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等[30]。表2列舉了幾種不同微生物來源的耐熱β-半乳糖苷酶及酶學(xué)性質(zhì)。另外，真菌中霉菌乳糖酶也具有較高作用溫度，但酵母菌來源耐熱酶尚未見報(bào)道。通過對不同微生物來源的β-半乳糖苷酶進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)耐熱β-半乳糖苷酶在不同的溫度、pH及化學(xué)條件下均表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性[30-31]。

表2 不同微生物來源耐熱β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Enzyme properties of thermostable β-galactosidase from different microorganisms

4 展 望

作為重要的糖苷水解酶，針對β-半乳糖苷酶的研究多年來集中于兩個(gè)領(lǐng)域，一是新酶源的開發(fā)[32]；二是β-半乳糖苷酶催化活性的分子調(diào)控[33-35]。圍繞這兩個(gè)研究方向，作者重點(diǎn)綜述和分析了3個(gè)相關(guān)問題，包括β-半乳糖苷酶的家族分化及催化理論形成、酶源的開發(fā)與應(yīng)用、特殊酶學(xué)性質(zhì)表征以及分子結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展。新酶源的開發(fā)雖然可以為工業(yè)生產(chǎn)及人體需求提供具有特殊適應(yīng)性的酶（比如耐熱酶等），但是由于β-半乳糖苷酶催化機(jī)制中存在產(chǎn)物水解與轉(zhuǎn)糖苷合成的動態(tài)平衡以及底物抑制等因素，限制了酶的催化效率（包括水解催化及轉(zhuǎn)糖苷催化兩個(gè)方面），也制約了β-半乳糖苷酶的實(shí)際應(yīng)用。因此，實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶從理論研究到生產(chǎn)應(yīng)用的轉(zhuǎn)化還需要依靠有效的分子調(diào)控。與β-半乳糖苷酶新酶源的開發(fā)相比，基于“結(jié)構(gòu)-功能”關(guān)系的分子調(diào)控研究相對滯后。根據(jù)CAZy（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZymes）數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，到目前為止已有酶學(xué)性質(zhì)表征的β-半乳糖苷酶達(dá)到240個(gè)以上，而具有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的酶尚不足20個(gè)。這種酶學(xué)特性研究數(shù)據(jù)相對豐富，而結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不足的研究現(xiàn)狀一定程度制約了對β-半乳糖苷酶催化活性調(diào)控的研究進(jìn)展。因此，如何將已有豐富的酶學(xué)性質(zhì)數(shù)據(jù)資源與不斷積累的分子結(jié)構(gòu)與功能信息相結(jié)合，深入研究催化機(jī)理與調(diào)控機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶催化效率的有效調(diào)控，是β-半乳糖苷酶研究領(lǐng)域具有生命力的探索方向。

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