超高壓對草魚肌原纖維蛋白結構的影響

閆春子， 夏文水， 許艷順

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

草魚是重要的經(jīng)濟淡水魚，其肌原纖維蛋白占主要肌肉蛋白質(zhì)量的55%～65%。因此，了解肌原纖維蛋白結構變化對控制產(chǎn)品品質(zhì)有著重要意義。

超高壓技術是一種新興的非熱加工技術手段，物料經(jīng)過一定的壓力處理后，其微生物大部分被殺滅，內(nèi)源酶大部分被滅活。相比加熱殺菌，超高壓處理可較大幅度地保留食品原有的營養(yǎng)和風味[1]，因此，超高壓技術已經(jīng)作為商業(yè)保鮮手段被應用。近來，有報道表明，超高壓處理對蛋白結構有很大影響[2]，蛋白結構的變化又會影響魚肉品質(zhì)的變化。但是關于超高壓對草魚肉肌原纖維蛋白結構方面的影響卻鮮有報道。作者以草魚為原料，研究超高壓處理對草魚片肌原纖維蛋白結構的影響，包括總巰基和活性巰基、Ca2+-ATPase、表面疏水性、內(nèi)源熒光光譜、以及拉曼光譜分析，為超高壓技術在淡水魚加工保鮮中的應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚：市售。

1.2 設備

UHPF-600 MPa-50 L型超高壓處理設備：包頭科發(fā)食品機械有限公司產(chǎn)品；F-7000型熒光光譜儀：日本日立公司產(chǎn)品；RamTracer-200-HS型拉曼光譜儀：美國OptoTrace Technologies公司產(chǎn)品；精密電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；4K-15型高速冷凍離心機：美國Sigma Sartorius公司產(chǎn)品；D-8941型真空包裝機：Multivac公司產(chǎn)品；實驗室用pH計 FE20：梅特勒-托利多儀器有限公司（上海）產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理 將草魚宰殺去內(nèi)臟、魚頭、魚皮，用蒸餾水沖洗干凈，取背部魚肉作為研究對象，切成約3 cm×3 cm×1 cm方塊，于蒸煮袋真空密封好后用超高壓設備進行處理，壓力分別為200、300、400、500、600 MPa，保壓時間為 15 min。 未經(jīng)處理組記為0.1MPa，作為對照組。超高壓后所有樣品，在兩小時內(nèi)完成蛋白提取，并進行結構測定。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取 制備方法參照Lina R[3]的方法，并略作修改。取適量經(jīng)過不同超高壓處理的草魚肉，加入5倍體積緩沖液（pH 7.0），混勻，9 000 r/min 4℃離心10 min，棄去上清液，重復上述操作2次。沉淀加入4倍體積緩沖液，10 000 r/min勻漿。靜置30 min以充分溶解蛋白，9 000 r/min 4℃離心20 min，所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液。肌原纖維蛋白濃度的測定采用雙縮脲法測定，以牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白。

1.3.3 總巰基和活性巰基含量測定 參考Yongsawatdigul[4]等的方法，并略作修改。用 0.6 mol/L KCl溶液將肌原纖維蛋白稀釋到 2 mg/mL左右，取1 mL加入4 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液?；靹颍?4 mL溶液，加入0.4 mL Tris-HCl緩沖液，40℃水浴 25 min。以0.6 mol/L KCl溶液作為空白，在紫外分光光度計412 nm處測定吸光值。

1.3.4 Ca2+-ATPase活性測定 用0.6 mol/L KCl溶液將肌原纖維蛋白溶液稀釋到4.0～6.0 mg/mL左右。然后取1 mL蛋白溶液，分別加入0.5 mL 0.5mol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液、0.5 mL 0.1 mol/L CaCl2、1 mL 1 mol/L KCl溶液、6.5 mL 去離子水，最后加入20 mmol/L ATP溶液。置于25℃水浴預熱10 min，之后加入肌原纖維懸濁液，搖勻，等到加入20 mmol/L ATP溶液的時候開始記時，反應5 min后在反應體系中加入2.5 mL冰浴后的體積分數(shù)15%的三氯乙酸（TCA）溶液終止反應。另一組預先加入TCA溶液作為空白對照。反應結束后，將所得溶液離心（3 500 g，10 min），采用鉬酸銨法測定上清液中釋放的無機磷含量。

1.3.5 表面疏水性分析 參考Riebroya[5]等的方法測定其熒光強度，激發(fā)波長370.0 nm，發(fā)射波長480.0 nm?？瞻子寐然浘彌_液替代。

1.3.6 內(nèi)源熒光測定 把肌原纖維蛋白溶液用0.6mol/L KCl溶液稀釋到0.05 mol/mL，選取激發(fā)波長295 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為2.5 nm，波長掃描范圍為300～400 nm，掃描速度為12 000 nm/min，每個樣品做3次平行。

1.3.7 拉曼光譜分析 拉曼光譜用 RamTracer?-200-HS便攜式拉曼儀測量，激發(fā)波長785 nm，掃描范圍100～3 300 cm-1，光譜分辨率 6 cm-1。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)結果采用Origin 9.1進行分析處理。

2 結果與討論

2.1 總巰基和活性巰基含量的變化

肌原纖維蛋白分子約含有42個巰基，其中分布在球狀頭部結構的約有24或者26個，反應活性很強，是肌原纖維蛋白活性的重要組成部分。因此可以根據(jù)蛋白質(zhì)巰基的含量變化情況進而預測蛋白質(zhì)的變性程度[3]。

圖1 不同壓力處理后草魚肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基變化Fig.1 Changes in total sulfhydryl content and surfacereactive sulfhydryl content activity of myofibrilproteinof grass carp subjected to different high pressure processing

由圖1可以看出，經(jīng)過超高壓處理過的草魚片，肌原纖維蛋白總巰基含量隨著壓力的增大呈現(xiàn)減小的趨勢，而活性巰基隨著壓力的增大呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢。在300 MPa時達到最大值，這與Hormann[6]和Chapleau[7]得到的結果一致。這是由于超高壓處理之后，肌原纖維蛋白的活性位點發(fā)生變化或者移動，導致蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性從而展開，隱藏在蛋白結構內(nèi)部的殘基、巰基開始逐漸暴露于蛋白表面，并且隨著壓力的升高，巰基暴露逐漸增多，300 MPa處理后達到最大，而當壓力繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)分子結構因為聚集而變得更加緊密，導致活性巰基含量減少[8]。此外，暴露于表面的巰基易于氧化生成二硫鍵，從而進一步導致總巰基含量的下降。

2.2 表面疏水性的變化

肌原纖維蛋白質(zhì)的表面疏水性反映的是蛋白質(zhì)分子表面的疏水性殘基的相對含量，其變化可以表明蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)發(fā)生改變，因此可作為蛋白質(zhì)結構改變的表征指標。超高壓對蛋白質(zhì)空間結構的改變對疏水性氨基酸殘基在蛋白質(zhì)分子內(nèi)外的分配產(chǎn)生影響，當肌原纖維蛋白分子發(fā)生變性時，內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露于表面，能與ANS（1-苯氨基萘-8-磺酸）探針結合呈現(xiàn)熒光，且肌原纖維蛋白的相對熒光強度與其表面疏水性成正相關[9]。

不同的超高壓處理對草魚肌原纖維蛋白表面疏水性的影響見圖2，從圖中可以看出，隨著壓力的不斷增大，表面疏水性一直呈現(xiàn)上升的趨勢，200～600 MPa處理后表面疏水性值分別上升了11%、55%、73%、76%、82%。主要的原因是超高壓處理改變了肌原纖維蛋白的空間構型。

新鮮的草魚肉蛋白質(zhì)的疏水性基團大多位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，故具有較低的表面疏水性。在蛋白質(zhì)中具有疏水相互作用的基團為芳香族殘基，它們均勻地分布在肌球蛋白分子尾部，包埋于α-雙螺旋之間的界面內(nèi)。

經(jīng)過超高壓處理之后，折疊態(tài)的肌原纖維蛋白分子開始伸展，位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的部分疏水性基團外露，引起蛋白質(zhì)分子表面疏水性的上升（見圖2）。隨著壓力的逐步增大，疏水性基團外露的越來越多，導致疏水相互作用增強，同時這些疏水性殘基就會重新分布，有更多的殘基暴露于蛋白表面，從而表面疏水性增加[7]。

圖2 不同壓力處理后草魚肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig.2 Changes in surface hydrophobicityof myofibril protein of grass carp subjected to different high pressure processing

2.3 Ca2+-ATPase活性的變化

Ca2+-ATPase活性源于肌原纖維蛋白的球狀頭部結構，其活性與頭部區(qū)域緊密相關，是分析蛋白質(zhì)品質(zhì)的重要指標[11]。

圖3為不同壓力處理對肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響，由圖可以看出，隨著壓力的增大，Ca2+-ATPase的活性呈現(xiàn)一直下降的趨勢。經(jīng)200 MPa處理，Ca2+-ATPase的活性由對照組的0.52 μmol/（mg·min）降低至 0.46 μmol/（mg·min），其活性下降12%，當壓力超過200 MPa時，Caμ-ATPase的失活速度逐漸加快，該研究結果同KO[10]等人一致。300 MPa以上的超高壓處理可以明顯降低Ca2+-ATPaes的活性，由圖 3 分析可知，300、400、500、600 MPa分別降低了27%、63%、79%、85%，隨著壓力的增大，其活性顯著下降。其中600 MPa處理下降的最為明顯。雒莎莎等人研究顯示，超高壓處理明顯抑制了肌球蛋白Ca2+-ATPase的活性，當壓力≥150 MPa時，Ca2+-ATPase的失活速度明顯加快。另外，總巰基含量的減少，導致蛋白分子內(nèi)作用加強，會加劇Ca2+-ATPase的活性下降。

Ca2+-ATPase活性的降低表明超高壓能夠誘導肌原纖維蛋白頭部變性，在相對較低的壓力下，肌原纖維蛋白（粗絲的主要成分）就開始聚集，兩個頭部S1和S2首先融合成一個，接著它們聚集成一簇，尾部呈放射狀的伸在外面。肌球蛋白分子的聚集不斷增加，蛋白質(zhì)的疏水性上升，這是因為超高壓作用使肌球蛋白頭部的疏水基團暴露出來，使肌球蛋白頭部間的疏水作用加強，從而導致肌原纖維蛋白聚集[11]。

圖3 不同壓力處理后草魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的變化Fig.3 Changes in Ca2+-ATPase activity of myofibril protein of grass carp subjected to different high pressure processing

2.4 內(nèi)源熒光光譜分析

超高壓處理會引起蛋白構象的改變，甚至引起蛋白質(zhì)分子變性。在此過程中，部分氨基酸中的內(nèi)源熒光生色基團的微環(huán)境和位置會發(fā)生相應的改變，因此，研究內(nèi)源熒光光譜是監(jiān)測超高壓處理對蛋白質(zhì)構象影響的有效手段。內(nèi)源熒光分析的主要是色氨酸（Trp）殘基，在295 nm處可只激發(fā)色氨酸殘基，從而可以排除酪氨酸殘基的干擾。圖4為不同壓力處理后得到的內(nèi)源熒光光譜圖，從圖4中可以看出，在壓力的作用下，肌原纖維蛋白的熒光光譜形狀變化不明顯，而對最大峰值以及強度的變化較為明顯。肌原纖維蛋白的λmax集中在336 nm附近。有研究學者研究表明，λmax與色氨酸殘基所處的微環(huán)境有著一定的關系[12]。λmax＜330 nm，表明色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性環(huán)境中。λmax＞330 nm，表明色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中。如圖中所示，λmax位于336 nm附近，表明色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中。隨著壓力的不斷增大，熒光光譜的熒光強度不斷增大，到600 MPa時達到最大。并且，λmax發(fā)生了一定的紅移現(xiàn)象。這說明色氨酸殘基可能是轉(zhuǎn)移到蛋白分子外部，暴露在了極性環(huán)境中，而經(jīng)過超高壓處理后，熒光強度不斷增強，色氨酸殘基都暴露到分子表面極性強的環(huán)境中，這表明超高壓處理改變了色氨酸的微環(huán)境，對肌原纖維蛋白的三級結構產(chǎn)生影響。

圖4 不同壓力處理后草魚肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光圖Fig.4 Changes inEndogenous fluorescence spectrumof myofibrilprotein ofgrass carp subjected to different high pressure processing

2.5 拉曼光譜分析

拉曼光譜是一種振動光譜技術，具有指紋式的高分辨率，對于分子結構分析有顯著作用，是研究蛋白構象的一種重要手段。

經(jīng)超高壓處理后，草魚片肌原纖維蛋白的拉曼圖譜見圖5。在拉曼圖譜上最突出的譜帶位于1 450 cm-1左右區(qū)域和1 650 cm-1左右區(qū)域，1 450 cm-1左右區(qū)域是C-H（CH2）彎曲振動譜帶。C-H彎曲振動的譜帶強度變化與蛋白質(zhì)的三級結構的變化相關，其強度減弱表明部分內(nèi)部疏水性殘基的暴露[13]。酰胺I帶集中于1 650 cm-1左右區(qū)域，常常用來被表征蛋白質(zhì)二級結構[14]。有研究顯示，位于1 600～1 700 cm-1左右的酰胺I帶與蛋白骨架構象類型相關：主要來自于C=O伸縮振動和N-H平面彎曲振動。該譜帶由位于1 645～1 660 cm-1（α-螺旋），1 665～1 680 cm-1（β-折疊），1 660～1 665 cm-1（無規(guī)則卷曲）三部分重疊的譜帶構成。

3 結 語

超高壓處理導致草魚肌原纖維蛋白空間構象顯著變化。隨著壓力的增大，Ca2+-ATPase活性、總巰基含量均顯著下降，活性巰基先增加后降低。肌原纖維肌球蛋白的球狀頭部結構在壓力作用下展開，疏水集團暴露，二硫鍵增多，并隨著壓力的進一步增大，蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集。內(nèi)源熒光和拉曼光譜表明，超高壓處理改變了肌原纖維蛋白二級、三級結構，導致蛋白質(zhì)變性。

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