論樣品與標(biāo)準(zhǔn)品體系的差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

◎ 劉 猛

（遼寧省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，遼寧 沈陽 110144）

溶劑效應(yīng)是指當(dāng)樣品中某些組分在溶解溶劑與流動(dòng)相中存在的差異較大導(dǎo)致的色譜行為異常的情況，因此在用液相色譜檢測時(shí)，通常會(huì)選擇初始比例的流動(dòng)相來溶解樣品，其目的是避免溶劑效應(yīng)引起的峰型變差帶來的定量不準(zhǔn)確等后果，這一點(diǎn)對于大多數(shù)樣品非常適用。但定量是以定性為前提的，因此除了溶劑體系的差異所引起的溶劑效應(yīng)外，樣品本身與標(biāo)準(zhǔn)品的pH值的差異在定性時(shí)帶來的影響也是不容忽視的。本文描述了在使用高效液相色譜儀檢測市售濃縮冷面湯中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉時(shí)，如何解決樣品中目標(biāo)物保留時(shí)間漂移引起的無法準(zhǔn)確定性，進(jìn)而無法出具定量報(bào)告的問題。

1 材料及方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

美國PerkinElmer公司Altus A-30 超高效液相色譜儀，配有PDA檢測器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器和Empower軟件；色譜柱：C182.1 mm×50 mm，1.7 μm；Eppendorf移液槍；pH計(jì)，梅特勒。

1.1.2 試劑

甲醇：色譜純，F(xiàn)isher公司；乙酸銨：色譜純，TCI公司；超純水：密理博；安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品：1.0 mg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心GBW；25%氨水：優(yōu)級(jí)純，Merck。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用純水配制含苯甲酸、山梨酸、糖精鈉安賽蜜濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.4 實(shí)際樣品

市售袋裝濃縮冷面湯。實(shí)驗(yàn)中，樣品加標(biāo)終濃度均為 1 μg/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儀器方法

流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：20 mmol/L乙酸銨，按A∶B=5∶95比例等度洗脫[1]；柱流速0.45 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫，室溫；PDA檢測波長230 nm[1]，采樣頻率20 point/s。

1.2.2 樣品處理

冷面湯樣品用純水稀釋10倍上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題

用1.2.1方法進(jìn)行檢測，標(biāo)準(zhǔn)品峰型及分離效果均正常，如圖1所示，按出峰前后順序，分別為安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉。

圖1 四種標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

上機(jī)檢測1.2.2得到的實(shí)際樣品，結(jié)果如圖2所示。圖2中，上方的線為冷面湯樣品，下方的線為用1.2.1中流動(dòng)相配制的混標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)際樣品譜圖進(jìn)行了對比，通過保留時(shí)間判斷，初步判定冷面湯樣品中沒有待測的4種添加劑。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，向冷面湯中添加標(biāo)樣后再上機(jī)檢測，結(jié)果如圖3所示。

圖2 實(shí)際樣品與標(biāo)準(zhǔn)品對比圖

圖3 實(shí)際樣品與樣品加標(biāo)對比圖

圖3中，上方的線為樣品，下方的線為加標(biāo)樣品，在冷面湯樣品中山梨酸和糖精鈉，由標(biāo)準(zhǔn)體系中的2.5 min后出峰，提前到2.4 min前出峰，并且兩個(gè)峰分離度變差，達(dá)不到基線分離。在對比了冷面湯樣品和樣品加標(biāo)后的譜圖不難發(fā)現(xiàn)，在實(shí)際樣品中是存在糖精鈉的。但由于糖精鈉在標(biāo)準(zhǔn)品和冷面湯樣品中出峰時(shí)間相差較大，無法通過軟件定量分析。因此糖精鈉在不同體系中保留時(shí)間匹配不上及其與山梨酸分不開的問題亟待解決。

2.2 解決措施

首先在檢測冷面湯樣品時(shí)調(diào)整了儀器檢測條件，如降低柱流速、更改檢測波長、采樣頻率、降低甲醇比例至2%，這些條件的更改對于樣品中山梨酸和糖精鈉的分離沒有起到改善作用。由此分析，在檢測實(shí)際樣品才會(huì)出現(xiàn)問題，初步判斷是樣品自身和標(biāo)準(zhǔn)品的差異過大所導(dǎo)致，接下來測量樣品和配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液pH值。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品溶液pH值為6.7，而冷面湯樣品的pH值僅為2.8。為了確認(rèn)是pH值引起的樣品中目標(biāo)峰漂移，對制樣的過程嘗試調(diào)整。

在稀釋樣品前，先用氨水調(diào)節(jié)樣品pH值至6.7±0.1，調(diào)整流動(dòng)相比例為甲醇∶乙酸銨（7∶93，V/V）將樣品稀釋10倍[2]，最后加標(biāo)上機(jī)檢測。但1.2.1中的等度洗脫條件仍然無法將山梨酸和糖精鈉分離開，于是又嘗試用梯度洗脫進(jìn)行分離。經(jīng)過優(yōu)化，最終確定儀器條件為柱流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL；柱溫，室溫；PDA檢測波長230 nm，采樣頻率20 point/s，梯度洗脫條件表見表1。

表1 梯度洗脫條件表

經(jīng)過優(yōu)化后，加標(biāo)樣品中的山梨酸和糖精鈉可以達(dá)到基線分離，見圖4。將加標(biāo)的樣品和未加標(biāo)樣品、以及流動(dòng)相配制的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，4種目標(biāo)物在任何體系中保留時(shí)間都未漂移（見圖5），可以定性定量分析。

圖4 優(yōu)化后的樣品加標(biāo)色譜圖

圖5 對比圖

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)可以看出，溶劑效應(yīng)不僅僅局限于目標(biāo)物在不同溶劑體系中溶解度不同引起的峰型變差，還體現(xiàn)在酸堿度不同引起的目標(biāo)物電離狀態(tài)的不同而引起的峰漂移。因此，對于液相色譜分析而言，保留時(shí)間的匹配是準(zhǔn)確定量的前提，盡可能地保證樣品稀釋劑體系與流動(dòng)相體系相同，才能避免溶劑效應(yīng)所引起的各種色譜行為異常的現(xiàn)象，為準(zhǔn)確定量提供保障。

[1]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 5009.28-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[2]劉 麗，彭名軍，鄭志偉，等.UPLC法同時(shí)測定食品中5種添加劑[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，37（12）：2318-2319.