氮肥減施對玉米幼苗根系分泌物影響的根際代謝組學(xué)分析*

彭鈺潔, 程 楠, 李佳佳, 孔楊鷺, 孫彩霞

(東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院 沈陽 110169)

植物根系分泌物高度影響和調(diào)節(jié)著根際土壤的物理特性、營養(yǎng)有效性以及植物根系與根際土壤微生物、病原菌及其他生物之間化學(xué)信號交流的生物學(xué)過程[1-2]。根系分泌物的化學(xué)特性以及精確定量分析是更好理解根際過程的主要先決條件。由于根系分泌物的局部沉積, 土壤微生物對其降解以及根際土壤的動態(tài)吸附作用, 對根系分泌代謝物進行定量及定性分析變得相對困難[3]。近年來, 非靶標(biāo)無偏向性的根際代謝組學(xué)(rhizosphere metabolomics)技術(shù)平臺的發(fā)展, 使得對根土界面內(nèi)根系分泌物組進行分析成為可能[4-6]。核磁共振(NMR)具有無破壞性、無偏向性、高靈敏度以及測量快速等特點,是代謝組學(xué)研究主要的分析技術(shù)平臺之一, 已經(jīng)應(yīng)用NMR方法對植物地上部的生理生態(tài)學(xué)問題進行了大量研究[7], 而應(yīng)用該方法進行地下植物分泌作用方面的研究則相對有限。如何收集原生狀態(tài)的根系分泌物是根際代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵。通常采用營養(yǎng)液、瓊脂、滅菌石英砂等基質(zhì)進行植物培養(yǎng)收集根系分泌物, 從而可以避免根際微生物的影響, 有效消除土壤環(huán)境噪音[8]。然而根系生長介質(zhì)會影響根系構(gòu)型、分泌方式和分泌物構(gòu)成, 同時考慮到農(nóng)業(yè)田間生產(chǎn)實際, 尤其是當(dāng)需要關(guān)注土壤物理性狀(如機械阻力、孔隙度等)對根系分泌過程擾動時,土壤是最佳培養(yǎng)基質(zhì)。本文基于植物土壤培養(yǎng), 實施了根系土壤瀝出、根鞘土收集及短期水培養(yǎng)3種根系分泌物收集方案, 對于建立根際生態(tài)學(xué)研究方法, 理解根土相互作用而言具有重要意義。

植物內(nèi)的氮素狀態(tài)及土壤環(huán)境的氮素水平對植物根系分泌物的數(shù)量和構(gòu)成具有重要影響[9]。在化學(xué)氮肥減量施用條件下, 作物根系分泌過程及分泌物的響應(yīng)特征, 是降低氮肥使用量、改善氮利用率,進而減緩氮過剩引發(fā)的環(huán)境負效應(yīng)以及實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)過程中亟需明確的關(guān)鍵問題。目前鮮有在氮肥減施條件下玉米(Zea maysL.)根系代謝組學(xué)特征的報道。本文基于核磁共振波譜法研究了不同氮肥減施量對玉米幼苗根系分泌物及根際代謝物組的影響, 從而為獲取優(yōu)化根際內(nèi)氮平衡和提高氮利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 玉米幼苗土壤培養(yǎng)及根系分泌物收集

以玉米雜交品種‘鐵研38’為材料進行盆栽試驗(盆缽直徑25 cm, 高40 cm)。盆栽用土為東北地區(qū)典型潮棕壤土, pH 5.46, 含有機質(zhì) 17.8 g?kg-1、全氮1.36 g?kg-1、堿解氮 52.9 mg?kg-1、速效磷 22.7 mg?kg-1、速效鉀 83.5 mg?kg-1。以常規(guī)施氮量 180 kg?hm-2為對照(N100), 氮肥減施處理用量分別為常規(guī)用量的85%(N85, 153 kg?hm-2)、55%(N55, 99 kg?hm-2)。磷肥和鉀肥均采用75 kg?hm-2的常規(guī)施肥量。按照不同施氮量稱取相應(yīng)肥料與土壤混合裝盆, 每種施氮量種植21盆。玉米種子催芽后播種, 盆缽置于光照培養(yǎng)箱中,出苗后每盆定苗3株。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為28 /18 ℃℃(晝/夜), 其他條件按照常規(guī)設(shè)置。培養(yǎng)28 d后, 將不同施氮量處理的玉米幼苗從光照培養(yǎng)箱中取出并分別按照下述不同方案收集根系分泌物: 1)土壤瀝出液收集法(soil leachate, SL): 按照 Zhu等[9]的方法并稍作修改, 將帶苗盆缽置于燒杯上, 緩慢將蒸餾水經(jīng)由植株莖基部澆入土壤, 收集盆缽底部土壤瀝出液, 經(jīng)0.45 mm濾膜過濾后, 收集濾液于-80 ℃冰箱凍存。2)根鞘土收集法(rhizosheath soil, RS): 按照Ma等[10]的方法并稍作修改, 將玉米幼苗小心從土壤中分離, 注意保留根鞘土, 將帶有根鞘土的玉米根系在裝有蒸餾水的離心管中反復(fù)浸洗, 將收集到的土水混合物渦旋震蕩 30 s, 6 700 r?min-1離心 10 min, 收集上清液于-80 ℃冰箱凍存。3)短期水培養(yǎng)收集法(distilled water cultivation, DWC): 按照Valentinuzzi等[11]的方法并稍作修改, 將土壤培養(yǎng)的玉米幼苗根系沖洗干凈, 轉(zhuǎn)移到裝有蒸餾水的培養(yǎng)瓶中, 培養(yǎng)瓶外部用錫箔紙包裹,對根部做遮光處理, 繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng), 6 h后取出, 經(jīng)0.45 mm濾膜過濾培養(yǎng)液, 收集濾液于-80 ℃冰箱凍存, 為將該方案與常規(guī)營養(yǎng)液液體培養(yǎng)收集法相區(qū)分, 將其稱為短期水培養(yǎng)收集法。同時, 按照 SL方法收集無植物土壤培養(yǎng)的瀝出液為空白對照(CK)。每種樣品收集方案中各施氮量處理分別重復(fù) 6次, 無植物土壤培養(yǎng)對照重復(fù)3次。

1.2 核磁共振氫譜(1H NMR)采譜

采用真空冷凍干燥器將凍存的根系分泌物樣品干燥。干燥后樣品加入650 μL磷酸鹽緩沖液[0.1 mol·L-1,pH=7.0, H2O∶D2O=9∶1, 內(nèi)含 1 mmol·L-13-三甲基甲硅烷基丙酸-d4鈉鹽(TSP)], 18 000 g離心20 min, 取600 μL上清液轉(zhuǎn)移到核磁管中進行檢測。用核磁共振波譜儀(Bruker Biospin, AV 600, Germany)調(diào)用zg 30脈沖序列進行1H NMR采集。600 MHz、300 K條件下, 對FID進行128 T累加, 譜圖寬度設(shè)為6 009 Hz、采樣點數(shù)為32 k, 每次掃描在3.5 s內(nèi)完成。將所得NMR譜圖用TopSpin軟件進行自動Fouier變化、相位校正和基線校正, 并將TSP的甲基質(zhì)子信號的峰值位移定位為零(δ0), 對化學(xué)位移進行定標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

使用 MestRe-C 軟件將整個譜圖(δ9～-0.04)以δ0.04區(qū)間為單位積分, 其中刪除殘留水峰區(qū)(δ4.55～4.95)。為消除樣本個體間濃度差異的影響, 把TSP峰面積定位為1進行數(shù)據(jù)歸一化處理。為增加各個變量在不同樣本中的可比性, 按照Par標(biāo)度化(Par-scaling)方法進行數(shù)據(jù)中心化及標(biāo)準(zhǔn)化處理。將處理后的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入 SIMCA-P13.0軟件進行偏最小二乘法-判別分析(Partial least squares projection to latent structuresdiscriminant analysis, PLS-DA)。采用SPSS 13.0對指認代謝物的相對含量進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同收集方法的玉米幼苗根系分泌物的1H NMR譜圖

本研究基于玉米土壤培養(yǎng), 分別收集了玉米幼苗的根系土壤瀝出液(SL)、根鞘土浸提液(RS)、根系水培養(yǎng)液(DWC)內(nèi)的根系分泌物, 同時以無植物培養(yǎng)的土壤為對照(CK)。因不同施氮量下不同根系分泌物收集方案獲得的譜圖輪廓相似, 此處僅以常規(guī)施氮量為例進行分泌物指認和譜圖比較。研究結(jié)果表明:在常規(guī)施氮量條件下, 不同收集方式獲取的根際及根系分泌物提取液的核磁共振氫譜圖有明顯差別(圖1)。SL與CK的譜圖輪廓相似; 與SL法比較, RS和DWC法可獲得較多的峰信號。根據(jù)核磁波譜數(shù)據(jù)庫和文獻[12]對核磁共振氫譜的主要特征譜峰進行歸屬,如圖1所示。可能是由于特定根系分泌物發(fā)生了局部沉積或者是微生物的降解作用以及土壤顆粒的吸附作用, 3種收集方案獲取的根系分泌物的數(shù)量上有所不同。采用RS和DWC根系分泌物收集方法并結(jié)合1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)平臺可以檢測到玉米幼苗根系分泌物中有糖、有機酸、氨基酸等組分。

2.2 玉米幼苗根系及根際代謝組的PLS-DA分析

采用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)簡化和降維的常用方法即PLS-DA對不同收集方式的常規(guī)施氮處理下玉米幼苗根系分泌物的1H NMR輪廓進行判別分析。結(jié)果表明: 3種收集方法提取液中的代謝物輪廓呈現(xiàn)明顯的分組; SL與CK分組不明顯(圖2a)。其中, 對SL法與 RS法代謝物輪廓分組貢獻較大的主要標(biāo)記物為葡萄糖和丙氨酸(圖2b, e); 對SL法與DWC法代謝物輪廓分組貢獻較大的主要標(biāo)記物為乙酸、乳酸、琥珀酸、蔗糖、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甜菜堿(圖2c, f); 對RS法與DWC法代謝物輪廓分組貢獻較大的主要標(biāo)記物為乙酸、乳酸、琥珀酸和異亮氨酸(圖2d, g)。RS和DWC兩種方案的代謝物輪廓與對照組的分離效果均較好。

圖1 不同收集方法的常規(guī)施氮下玉米幼苗根系分泌物的典型1H NMR譜圖Fig. 1 Typical 1H NMR spectra of root exudates of maize seedlings collected by different methods conventional nitrogen application

2.3 不同施氮量條件下玉米幼苗根系分泌物的變化

從圖3可以看出, 在不同施氮量條件下, 根鞘土浸提(圖3a, 3b, 3c的1H NMR譜圖輪廓與短期水培養(yǎng)收集圖3d, 3e, 3f)的根系分泌物有明顯差別; 同時, 同種收集方式下隨著施氮量的不同, 整個1H NMR譜圖輪廓亦發(fā)生一定程度的變化。由表1可知,與氮肥常量施用比較, 在氮肥減施條件下, 僅有 α-葡萄糖顯著增加(變幅高達1.44倍,P＜0.05), 其他玉米幼苗根鞘土內(nèi)的分泌物水平?jīng)]有發(fā)生顯著性改變;短期水培養(yǎng)的根系分泌物水平變化相對明顯, 蘋果酸、亮氨酸、纈氨酸顯著增加, 變幅分別為1.32倍、1.20倍和 1.46倍, 但是隨著氮肥減施量的增加, 這些代謝物水平不再繼續(xù)增加, 呈下降趨勢。

3 討論與結(jié)論

3.1 玉米幼苗根系分泌物收集及根際代謝組學(xué)分析

根際代謝組學(xué)旨在分析整個根土交互界面的代謝物組, 包括與植物根系分泌作用相關(guān)的初生代謝物、化學(xué)信號物質(zhì)等, 以及與根系相關(guān)的微生物菌群的分泌物[6]。最早, Fan等[12]基于營養(yǎng)液培養(yǎng)法,建立了小麥(Triticum aestivumL.)、大麥(HordeumvulgareL.)和水稻(Oryza sativaL.)根系分泌物的NMR非靶標(biāo)分析的工作流程。隨后, Escudero等[4]采用1H NMR分析了在滅菌沙培條件下西紅柿(Lycopersicon esculentumL.)幼苗根系分泌物。精確對根系分泌物的數(shù)量和構(gòu)成進行分析需要合理的試驗設(shè)計。如前所述, 雖然采用營養(yǎng)液、滅菌沙等基質(zhì)進行植物培養(yǎng)并收集根系分泌物的方法具有控制土壤環(huán)境噪音干擾的優(yōu)勢, 但是其無法模擬植物的實際生境而存在局限性。本研究結(jié)合玉米土壤盆栽培養(yǎng)實驗, 對經(jīng)過土壤瀝出、根鞘土浸提及短期水培養(yǎng)收集的根系分泌物進行了1H NMR分析, 結(jié)果表明不同收集方法的根系分泌物的1H NMR譜圖輪廓及主要標(biāo)志物明顯不同, 根鞘土浸提和土培結(jié)合短期水培養(yǎng)均可用于根際代謝組學(xué)研究。

盡管我們將 3種方案的收集物均稱為根系分泌物, 實際上SL和RS法的收集物是根系分泌物和微生物分泌物、分解物的混合物[9]。但是這兩種方法可提供田間土壤培養(yǎng)條件下植物根際的真實信息,尤其適合用來探究植物與根際微生物發(fā)生相互作用之后的化學(xué)組成變化, 解讀根系分泌物的生態(tài)功能。將植物的土壤培養(yǎng)與短期水培養(yǎng)相結(jié)合的DWC方法, 可最大限度地控制由于土壤異質(zhì)性存在的環(huán)境噪音干擾。在自然田間條件下, 土壤微生物可通過分泌、沉積及其他活動影響根際微區(qū)的化學(xué)構(gòu)成[13-15]。尤其是, 一些土壤微生物參與了土壤氮循環(huán)[16], 所以考慮土壤微生物群落及活動對氮肥減施條件下根系分泌物構(gòu)成的影響是非常重要的。在土壤生物多樣性的復(fù)雜背景下, 根際代謝組學(xué)技術(shù)有利于真正獲取并理解根系分泌物的生態(tài)功能及農(nóng)業(yè)意義。植物根系分泌物的種類復(fù)雜, 收集方式及根際代謝組學(xué)技術(shù)平臺的靈敏度會限制能夠檢測的根系分泌物的數(shù)量, 尚需結(jié)合不同收集方法以及特定靶標(biāo)分析檢測處于皮摩爾水平的某些信號化合物。

圖2 不同收集方法的常規(guī)施氮量下玉米幼苗根系分泌物輪廓的PLS-DA分析Fig. 2 PLS-DA of metabolite profiles of root exudates of maize seedlings under conventional nitrogen application obtained with different methods

3.2 氮肥減施對玉米幼苗根系分泌物的影響

圖3 不同施氮量下的玉米幼苗根系分泌物的典型1H NMR譜圖Fig. 3 Typical 1H NMR spectra of root exudates of maize seedlings grown under different nitrogen fertilizer rates

表1 相對于常規(guī)施氮量不同減氮處理[85%(N85)和55%(N55)常規(guī)施氮量]下玉米幼苗根系分泌代謝物的變化比Table 1 Change rates of metabolites in root exudates of maize seedlings under different reduced-nitrogen application conditions[85% (N85) and 55% (N55) conventional nitrogen application]relative to conventional nitrogen application (180 kg·hm-2)

增施氮肥是促進玉米籽粒增產(chǎn)及提高生物量的主要策略之一。然而, 增施氮肥導(dǎo)致的氮過剩以及氮利用率降低已經(jīng)產(chǎn)生土壤酸化、環(huán)境污染、土壤微生物活力下降等負面影響[17]。減少氮肥施用量,控制氮供給, 降低土壤氮損耗風(fēng)險, 是改善氮利用率促進玉米可持續(xù)生產(chǎn)的有效途徑。植物固定碳總量的 20%～50%可以轉(zhuǎn)移到根系, 其中 10%～18%經(jīng)由根系分泌物釋放到土壤中[18]。根系分泌物的分泌過程同時依賴于植物的生理狀態(tài)和土壤的營養(yǎng)有效性。土壤營養(yǎng)有效性的高低會影響植物源向根系分泌物的分配。本研究表明, 與常規(guī)施氮量比較,減氮條件下, 除 α-葡萄糖顯著增加外, 玉米幼苗根鞘土內(nèi)的分泌物水平基本上沒有發(fā)生顯著改變; 短期水培養(yǎng)的根系分泌物水平的變化相對明顯, 蘋果酸、亮氨酸、纈氨酸顯著增加, 但是隨著氮肥減施量的增加, 這些代謝物水平不再繼續(xù)增加, 呈下降趨勢。

根系分泌物中的糖和糖醇可作為許多微生物的能量源和通用的趨化性物質(zhì)[9,19]。根系分泌物中的蘋果酸可能與特定的促進根圍細菌向化吸引的植物生長有關(guān)系。植物根系分泌物中的碳水化合物和氨基酸可以作為向化因子引誘植物生長, 促進根圍細菌到植物根際區(qū)域從而有助于植物的生長[20]。根系分泌物中數(shù)量比較多的糖、氨基酸和有機酸等組分和植物應(yīng)對土壤營養(yǎng)供應(yīng)不足的適應(yīng)性調(diào)整有關(guān)[1,9]。這種適應(yīng)性的分子機制尚不十分清楚, 但是可能與植物內(nèi)源激素有關(guān)。生長素促進質(zhì)膜 H+-ATPase活性增加, 為次級主動運輸過程提供了更強的驅(qū)動力,從而可將滲漏的糖、有機酸和氨基酸再次回輸[21]。

根系分泌物在植物避免重金屬毒害, 土壤電性的產(chǎn)生, 蛋白或藥化物質(zhì)的生成, 寄生蟲、病原菌及其天敵的相互作用, 微生物生長的促進方面均發(fā)揮了重要作用[18]; 另外, 植物可通過根系分泌物的增溶作用、還原/配位作用、配體交換反應(yīng)影響土壤營養(yǎng)有效性[11]。有研究表明, 根系分泌物的釋放可以通過增加土壤碳素有效性(輸入水溶性碳)而降低潛在的氮損耗風(fēng)險[22]。Carvalhais等[21]基于液體培養(yǎng)的研究結(jié)果表明, 氮虧缺條件下玉米根系分泌物中的氨基酸(尤其是天冬氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、賴氨酸)和麥芽糖含量下降。Zhu等[9]研究表明, 土壤瀝出液中玉米根系分泌物總量隨著施氮量的增加而增加。與無氮施加對照比較, 在320 kg?hm-2的高氮條件下(高出最適量的 2.0～3.2倍), 玉米根系分泌物中的糖、糖醇、酚顯著增加, 而羧酸類化合物、胺類、多元醇、脂類在兩種施氮量下沒有顯著差異。上述研究結(jié)果均表明, 氮素水平可影響玉米根系分泌物的數(shù)量和構(gòu)成, 而特定根系分泌物的數(shù)量水平與氮量之間的關(guān)系尚存歧義。這可能是由于根系分泌物的構(gòu)成和數(shù)量隨著植物生長的外部環(huán)境條件,如土壤類型、元素含量、pH、溫度、微生物的存在而發(fā)生變化[20,23]。另一個影響根系分泌物構(gòu)成和數(shù)量的重要因子是植物固有的生物學(xué)特性, 如植物種類、品系和發(fā)育階段。例如, M?nchgesang等[24]根據(jù)根系分泌物的非靶標(biāo)代謝物輪廓分析發(fā)現(xiàn), 19個擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)種質(zhì)材料的根際化學(xué)構(gòu)成存在自然遺傳變異。為適應(yīng)不同的環(huán)境, 植物根際存在高水平的化學(xué)多樣性。在氮肥減施條件下,不同玉米品種在不同生育時期及土壤環(huán)境條件下的根系分泌物數(shù)量和構(gòu)成尚需進一步研究。為獲取優(yōu)化根際內(nèi)氮平衡、提高氮利用率的有效解決途徑,根系分泌物及整個根土界面內(nèi)代謝物組的無偏分析與植物組織內(nèi)代謝物組的協(xié)同分析將有助于探查出土壤環(huán)境中引發(fā)植物促進生長的特定信號分子及植物內(nèi)在的環(huán)境適應(yīng)機制。

綜上所述, 本文研究結(jié)果表明, 與常規(guī)施氮量比較, 在 85%施氮量下, 玉米幼苗根系分泌物中的α-葡萄糖、蘋果酸、亮氨酸、纈氨酸水平顯著增加;而當(dāng)施氮量減少到55%時, 玉米幼苗根系分泌物水平不再顯著增加并呈現(xiàn)下降趨勢, 受施氮量影響變化顯著, 這可能和玉米根系對土壤氮營養(yǎng)供應(yīng)水平的適應(yīng)性調(diào)節(jié)有關(guān)。采用RS和DWC法收集根系分泌物并結(jié)合1H NMR技術(shù)進行根際代謝組學(xué)分析,可為根際生態(tài)及根際氮素營養(yǎng)研究提供重要理論依據(jù)。

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