甘蔗煙酰胺轉氨酶基因(SoNAAT1)的克隆及其在缺Fe脅迫下表達量變化

農 倩，李長寧，Mukesh Kumar Malviya，蘇 琴，張 艷，陳艷露，覃麗萍，謝 玲

(1.廣西農業(yè)科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007；2.農業(yè)部廣西甘蔗生物技術與遺傳改良重點實驗室/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】Fe是植物必需的營養(yǎng)元素，在各種生理生化代謝中具有非常重要的作用。土壤中Fe的含量很豐富，但植物可利用的可溶性Fe含量卻很低，世界上約30 %的土壤由于生物可獲得性Fe的缺乏而限制植物對Fe的吸收，嚴重影響農作物產量和品質[1]。甘蔗是我國重要的糖料作物，近年來，甘蔗主產區(qū)的幼苗出現(xiàn)嚴重的缺Fe失綠問題，影響了我國甘蔗生產及食糖安全。缺Fe脅迫下，植物具有兩種不同的Fe吸收利用系統(tǒng)，機理Ⅰ型植物主要通過酸化根表環(huán)境，提高根際還原效率，將Fe3+還原為Fe2+后被吸收利用；機理Ⅱ型僅存在于單子葉禾本科植物中，其可通過根系分泌大量具有很強的Fe3+螯合作用的Fe載體，促進植物對Fe的吸收[2-3]，分泌Fe載體的多寡與Fe吸收能力大小呈正相關。植物Fe載體主要由麥根酸及其衍生物組成[4]，麥根酸的生物合成途徑中，由煙酰胺轉氨酶(NAAT)催化煙酰胺生成酮類中間產物的反應是麥根酸類Fe載體合成過程的關鍵限速步驟[5-6]。因此，克隆甘蔗NAAT基因并分析其在缺Fe脅迫下的表達情況，對研究甘蔗Fe載體生物合成調控機理及抗逆育種均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】煙酰胺轉氨酶活性與植物根部分泌的麥根酸類物質量和缺Fe脅迫耐受性有關，如大麥NAAT在缺Fe脅迫下活性增強，恢復供Fe活性被抑制[7]。大麥中的2個NAAT基因在根部都受缺Fe強烈誘導表達，而水稻中發(fā)現(xiàn)的6個NAAT基因，只有NAAT1表達受缺Fe脅迫誘導[8-9]。將大麥NAAT基因轉入水稻后，轉基因植株分泌麥根酸類物質的能力顯著增強，根系Fe吸收量增加，植株對缺Fe的耐受性及產量也有所提高，顯示出NAAT基因在提高作物缺Fe耐受性的巨大潛力[10]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，已有報道在多種植物中克隆得到NAAT家族的相關基因[7-8,11-12]，然而對甘蔗NAAT基因尚無相關研究?！緮M解決的關鍵問題】采用反轉錄PCR(RT-PCR)與cDNA末端快速擴增(RACE-PCR)克隆編碼甘蔗煙酰胺轉氨酶的基因并進行生物信息學分析，探索其進化保守性及在缺Fe脅迫下的表達特性，為進一步探討該酶在麥根酸類Fe載體生物合成途中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗于2017年6月至9月在廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室玻璃溫室內進行。甘蔗品種選用新臺糖22號(ROC22)，蔗種首先砍成單芽，選取完好無損蔗芽在沙床中培育，待蔗苗長到3～4葉期時，篩選出大小基本一致、長勢均一幼苗移栽至裝有1/2 霍格蘭(Hoagland)營養(yǎng)液的桶中，桶大小為21 cm × 20 cm (直徑×高)，每桶盛營養(yǎng)液8 L，pH 6.0，置于通風陰涼處。為防止根系缺氧和有害分泌物積累，使用充氣泵每隔2 h充氣15 min，每4 d更換1次營養(yǎng)液，植株長勢恢復后進行分組處理：對照處理(Control，C)：1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，F(xiàn)e含量10 μmol·L-1；缺Fe脅迫處理(Fe Deficiency，F(xiàn)D)：營養(yǎng)液中Fe含量0.1 μmol·L-1，在處理2、4和7 d后，采集幼嫩根系分裝速凍于液氮中，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生理指標測定

根系內源脫落酸(ABA)含量采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，酶聯(lián)免疫試劑盒由中國農業(yè)大學植物生理與生物化學國家重點實驗室王保民教授提供，測定流程按說明書，使用ANTHOS-2010酶標儀測定，每個樣品重復測定3次。采用微量法測定過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，相關試劑盒購于蘇州科銘生物技術有限公司并按其說明書測定。采用DPS軟件進行數(shù)據(jù)方差分析，其中以Duncan’s新復極差法(P≤0.05)進行顯著性分析。

1.3 RNA提取及cDNA第一鏈合成

甘蔗根系總RNA采用Trizol法提取，Trizol試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司。實時熒光定量PCR所需cDNA由Formentas公司試劑盒合成，逆轉錄引物為 Oligo(dT)18，SoNAAT1基因全長擴增所需cDNA由Clontech公司試劑盒合成，使用試劑盒配備的逆轉錄引物。RNA提取及cDNA合成步驟按照說明書操作。

1.4 SoNAAT1基因全長克隆

根據(jù)課題組先前在基因芯片實驗中獲得的SoNAAT1 EST序列片段，設計3’-RACE引物：5’-CGGCTTGGATGGATAGTTACC-3’及5’-RACE引物：5’-CTGGACAAATGTTGGAGGATC-3’，然后分別結合Clontech公司RACE試劑盒提供的接頭引物18AP(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’)及UPM引物擴增SoNAAT1基因全長cDNA。擴增體系含：2×GoldStar Best Master Mix 25 μl、cDNA 2 μl、10 μmol·L-1的正向及反向引物各1 μl、以雙蒸水補齊至50 μl。擴增程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的條帶，連接至pMD18-T載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞后，篩選陽性克隆送去測序并進行序列拼接。拼接完成后，在基因編碼框首尾設計引物F: 5’-ATGGAGAACAGCGCCAGCAAGAG-3’和R: 5’-TCACT TTGCCGGGTTCTTGTATCG-3’進行擴增以驗證序列準確性，反應體系及程序如前所述。

1.5 SoNAAT1基因生物信息學分析

選用BlastP搜索蛋白質相似性(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)；使用ExPASy(http://expasy.org/tools/)分析編碼蛋白質的基本理化性質；通過ClustalW2程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)進行蛋白質多序列比對并由Espript (http://espript. ibcp.fr/ESPript/ESPript/)進行顏色渲染；使用MEGA 6.0程序(http://www.megasoftware.net/)繪制聚類分析圖；使用SOPMA軟件預測蛋白的二級結構。

1.6 實時熒光定量PCR

根據(jù)獲得的SoNAAT1基因序列設計熒光定量 PCR引物，其中正向引物序列SoNAAT1-F：5’-CTGGACAAATGTTGGAGGATC-3’，反向引物SoNAAT1-R：5’-CGGCTTGGATGGATAGTTACC-3’以甘蔗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，EF189713)為內參基因，設計內參引物，正向引物GAPDH-F：5’-TGGTGCTGACTATGTCGTGGA-3’，反向引物GAPDH-R：5’-CATGGGTGCATCTTTGCTTG-3’。實時熒光定量PCR擴增體系含：2×All-in-One qPCR Mix (Gene Copoeia) 10、2 μl cDNA、4 μmol·L-1正向及反向引物各1 μl、以無菌水補齊至20 μl。擴增程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。反應完成后進行融解曲線檢驗，按照2-ΔΔCt法計算基因表達水平的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 SoNAAT1基因全長cDNA克隆

以混合甘蔗根系cDNA為模板，SoNAAT1基因經(jīng)5’-和3’-RACE-PCR擴增獲得的產物長度分別為988 bp(圖1-A)和795 bp(圖1-B)。對目的條帶回收，連接轉化，藍白篩選后送上海生工公司測序，拼接后得到SoNAAT1基因全長cDNA為1593 bp，包含啟始密碼ATG和終止密碼TGA，開放閱讀框(Open read frame，ORF)長度為1206 bp(圖1-C)，編碼401個氨基酸，5’和3’端非翻譯區(qū)長度為98 和289 bp，3’非編碼區(qū)還包括一個19 bp ploy(A)尾巴，對該基因在NCBI上進行注冊，命名為SoNAAT1，獲得登錄號JQ292842。

2.2 序列生物信息學分析

通過Expasy工具分析表明SoNAAT1基因編碼蛋白等電點為5.64，分子量為44.2 kD，亞細胞定位于細胞質。SoNAAT1蛋白的疏水性預測發(fā)現(xiàn)，氨基酸鏈上第361位脯氨酸(Pro-361)疏水性最強，分值為2.544；分值最低的是第290位谷氨酸(Glu-290)，為-1.878；平均親水系數(shù)(GRAVY)為0.033，為疏水蛋白質。二級結構預測顯示該蛋白共出現(xiàn)4種構象：其中α-螺旋、隨機轉曲、延伸鏈和β-轉角、分別占比40.65 %、27.68 %、22.94 %和8.73 %。將獲得的SoNAAT1序列通過NCBI BlastP比對表明，其與玉米(NM_001138546)、水稻(Os11g0552000)和高粱(XP_002450952)的一致性/相似性依次為99 %/68 %、99 %/ 76 %和99 %/71 %，說明SoNAAT1與其他作物NAAT基因進化關系較近。通過與水稻、玉米、高粱NAAT家族基因的氨基酸序列聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，SoNAAT1與高粱SbNAAT3優(yōu)先聚在一個小分支。NAAT多序列比對結果表明(圖3)，甘蔗與上述3種作物的序列間高度相似，參與煙酰胺轉氨酶功能的關鍵氨基酸位點高度保守。

A: 5’-RACE產物; B: 3’-RACE產物；C: SoNAAT1編碼框擴增產物A: 5’-RACE-PCR amplified results; B: 3’-RACE-PCR amplified results; C: Open reading frame amplified results of SoNAAT1圖1 SoNAAT1基因的擴增結果Fig.1 Amplified products of SoNAAT1 gene

圖2 不同作物NAAT基因的氨基酸同源性分析Fig.2 Homology analysis of NAAT amino acid sequence from sugarcane and other crops

利用ClustalW2進行氨基酸序列比對并通過ESPript進行顏色渲染，深色背景表示一致序列，下標星號的為參與煙酰胺轉氨酶功能的關鍵氨基酸SoNAAT1 is aligned with NAAT proteins from Zea mays (Zm) and Sorghum bicolor (Sb) . The alignment was conducted by ClustalW2 and colored with ESPript, and dark backgrounds represents similar sequences. The asterisk corresponds to residues critical to aminotransferase function圖3 NAAT氨基酸序列多重比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of NAAT proteins

2.3 ABA含量及相關抗氧化酶活性變化

與對照相比，缺Fe脅迫處理的內源ABA含量呈增加趨勢，在處理后的2、4和7 d分別比對照增加21.3 %、26.1 %和30.7 %，均顯著高于對照(圖4-A)。缺Fe脅迫處理下相關抗氧化酶CAT、POD和SOD的活性均高于對照，但是各酶與對照之間的增量趨勢又有所不同。CAT活性在處理后2、4和7 d分別比對照增加42.8 %、75.4 %和78.2 %(圖4-B)，一直呈遞增趨勢，與對照差異顯著；POD和SOD的活性在處理后2、4和7 d分別比對照增加43.6 %、95.2 %和48.9 %(圖4-C)和4.4 %、25.8 %和16.9 %(圖4-D)，均呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。在缺Fe脅迫第2天，SOD活性沒有顯著改變，在脅迫第4、7天，POD和SOD的活性與對照差異顯著。

2.4 SoNAAT1表達量分析

以甘蔗GAPDH基因作為內參基因，利用實時熒光定量PCR技術分析SoNAAT1基因于缺Fe脅迫處理下在甘蔗根系中的轉錄水平。由圖5可知，SoNAAT1的表達隨著脅迫時間的延長而增強，在處理后的第2、4和7 天表達量分別是對照的2.8、3.4和6.7倍，表達量差異顯著。

同一處理時間內，標有不同小寫字母的處理間在0.05水平差異顯著Bars superscribed by a different lowercase letter are significantly different at the 0.05 probability level at the same treated time圖4 缺Fe脅迫處理下甘蔗根系ABA含量及相關抗氧化酶活性的變化Fig.4 Effects of Fe deficiency treatment on ABA content and antioxidant enzymes activity of sugarcane root

3 討 論

研究顯示，F(xiàn)e吸收機理Ⅱ型植物主要包含禾本科單子葉植物，這類植物耐受缺Fe脅迫能力的大小與植物根系分泌麥根酸類Fe載體的種類和數(shù)量息息相關。比如大麥是禾本科作物中麥根酸類Fe載體分泌數(shù)量最多的，其耐受缺Fe脅迫能力就較強；反之，水稻分泌麥根酸類Fe載體的能力不如大麥，其耐受缺Fe脅迫能力也較弱[2-3]。在機理Ⅱ型植物中，F(xiàn)e吸收的關鍵在于植物Fe載體的合成，煙酰胺轉氨酶(NAAT)是麥根酸類植物Fe載體合成過程中的關鍵限速酶[13]。本研究克隆得到編碼甘蔗煙酰胺轉氨酶的SoNAAT1基因全長，對該基因進行序列分析的結果表明，其擁有完整的編碼框，編碼的蛋白質序列與其他作物如玉米、水稻、高粱中的NAAT序列具有很高的同源性，尤其是與同屬C4作物的高粱SbNAAT3相似性極高，各作物的NAAT序列中參與煙酰胺轉氨酶功能的關鍵氨基酸序列高度保守，SoNAAT1基因表達量始終隨著缺Fe脅迫時間延長而不斷增加。這些結果說明SoNAAT1基因可能與水稻[8-9]、高粱[9]、玉米[9]、小麥[12]、大麥[14]、等植物中已研究的NAAT基因的功能相似，參與根系麥根酸類植物Fe載體合成，響應缺Fe脅迫等一系列逆境脅迫過程。

同一處理時間內，標有不同小寫字母的處理間在0.05水平差異顯著Bars superscribed by a different lowercase letter are significantly different at the 0.05 probability level at the same treated time圖5 缺Fe脅迫處理對甘蔗根系SoNAAT1表達量的影響Fig.5 Expression changes of SoNAAT1 gene in sugarcane roots under Fe deficiency treatment

研究表明，植物在遭受缺Fe脅迫時，會迅速激活Fe吸收系統(tǒng)，以提高植株吸收利用Fe的能力，此外，內源Fe再利用系統(tǒng)還會同時得到調節(jié)，活化植株體內存儲的Fe，并將其優(yōu)先輸送到生長旺盛部位，從而有效緩解缺Fe脅迫對植物生長造成的傷害[15]。研究顯示，植物響應缺Fe脅迫的生理和分子反應受到Fe吸收和代謝相關基因表達的調節(jié)，而多種激素和信號小分子參與了此類的調節(jié)作用[16-17]，如ABA參與調節(jié)了缺Fe脅迫下擬南芥內源Fe再利用的過程[18]。本研究結果顯示缺Fe脅迫能快速誘導ABA在根系中大量累積，且ABA積累和SoNAAT1基因表達量都隨著缺Fe脅迫時間延長而不斷增加，但SoNAAT1基因表達量與ABA合成是否存在定量或相互調節(jié)關系，還需進一步研究證實。CAT、POD和SOD是植物體內抗氧化酶系統(tǒng)的重要組分，共同作用于清除機體內過量的氧自由基，降低其對細胞的毒害作用，3種酶都是植物中重要的含F(xiàn)e蛋白酶[19]，因此缺Fe影響酶的活性[20]。本研究結果表明，短期的缺Fe脅迫處理下3種酶活性迅速提高，表明抗氧化酶防護系統(tǒng)能夠快速應答缺Fe處理，提高活性以減少過量氧自由基的產生對植物體造成的損害；隨著脅迫時間延長，雖然SoNAAT1基因表達量一直在增加，加大麥根酸類Fe載體的合成以增加植株對Fe的吸收能力，由于環(huán)境中可獲得Fe的缺乏，導致植株處于缺Fe狀態(tài)，POD和SOD活性呈先升高后下降的趨勢，與前人研究結果一致[21]，證實了缺Fe對含F(xiàn)e蛋白酶活性的影響。

4 結 論

甘蔗SoNAAT1基因編碼序列高度保守，表達量隨著缺Fe脅迫時間的延長而不斷增強，推測該基因參與了甘蔗麥根酸類Fe載體生物合成途徑的調控過程，缺Fe脅迫引起甘蔗根系內源ABA含量和相關抗氧化酶活性增加，并與SoNAAT1表達密切相關。

參考文獻：

[1]Guerinot M L，Yi Y. Iron：nutritious，noxious，and not readily available[J]. Plant Physiology，1994，104(3)：815-820.

[2]Marschner H，R?mheld V. Strategies of plants for acquisition of iron[J]. Plant Soil，1994，165(2)： 261-274.

[3]Kobayashi T，Nishizawa N K. Iron uptake，translocation，and regulation in higher plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2012，63(1)：131-52.

[4]Takagi S，Nomoto K，Takemoto T. Physiological aspect of mugineic acid，a possible phytosiderophore of graminaceous plants[J]. Journal of Plant Nutrition，1984，7(1-5)：469-477.

[5]Ma J F，Shinada T，Matsuda C，et al. Biosynthesis of phytosiderophores，mugineic acids，associated with methionine cycling[J]. Journal of Biological Chemistry，1995，270(28)：16549-16554.

[6]Inoue H，Higuchi K，Takallashi M，et al. Three rice nicotianamine synthase genesOsNAS1，OsNAS2 andOsNAS3 are expressed in cells involved in long-distance transport of iron and differentially regulated by iron[J]. Plant Journal，2003，36(3)：366-381.

[7]Takahashi M，Yamaguchi H，Nakanishi H，et al. Cloning two genes for nicotianamine aminotransferase，a critical enzyme in iron acquisition(StrategyII)in graminaceous plants[J]. Plant Physiology，1999，121(3)：947-956.

[8]Cheng L，Wang F，Shou H，et al. Mutation in nicotianamine aminotransferase stimulated the Fe(II) acquisition system and led to iron accumulation in rice[J]. Plant Physiology，2007，145(4)：1647-1657.

[9]Inoue H，Takahashi M，Kobayashi T，et al. Identification and localisation of the rice nicotianamine aminotransferase geneOsNAAT1 expression suggests the site of phytosiderophore synthesis in rice[J]. Plant Molecular Biology，2008，66(1-2)：193-203.

[10]Takahashi M，Nakanishi H，Kawasaki S，et al. Enhanced tolerance of rice to low iron availability in alkaline soils using barley nicotianamine aminotransferase genes[J]. Nature Biotechnology，2001，19(5)：466-469.

[11]Bashir K，Inoue H，Nagasaka S，et al. Cloning and characterization of deoxymugineic acid synthase genes from graminaceous plants[J]. Journal of Biological Chemistry，2006，281(43)：32395-32402.

[12]Beasley J T，Bonneau J P，Johnson A A T. Characterisation of the nicotianamine aminotransferase and deoxymugineic acid synthase genes essential to strategy II iron uptake in bread wheat (TriticumaestivumL.)[J]. PLoS ONE，2017，12(5)：e0177061

[13]Kanazawa K，Higuchi K，Nishizawa N K，et al. Nicotianamine aminotransferase activities are correlated to the Phytosiderophore secrotions under Fe-deficient conditions in Gramineae[J]. Journal of Experiment Botany，1994，45(281)：1903-1906.

[14]Kanazawa K，Higuchi K，Nishizawa N K，et al. Detection of two distinct isozymes of nicotianamine aminotransferase in Fe-deficient barley roots[J]. Journal of Experiment Botany，1995，46(290)：1241-1244.

[15]Jin C W，You G Y，He Y F，et al. Iron deficiency-induced secretion of phenolics facilitates the reutilization of root apoplastic iron in red clover[J]. Plant Physiology，2007，144(1)：278-285.

[16]Chen S，Sanchez-Fernandez R，Lyver E，et al. Functional characterization of AtATMl，AtATM2，and AtATM3，a subfamily ofArabidopsishalf-molecule ATP-binding cassette transporters implicated in iron homeostasis[J]. Journal of Biological Chemistry，2007，282(29)：21561-21571.

[17]Yang J L，Chen W W，Chen L Q，et al. The 14-3-3 protein GENERAL REGULATORY FACTOR11 (GRF11)acts downstream of nitric oxide to regulate iron acquisition inArabidopsisthaliana[J]. New Phytologist，2013，197(3)：815-824.

[18]Lei G J，Zhu X F，Wang Z W，et al. Abscisic acid alleviates iron deficiency by promoting root iron reutilization and transport from root to shoot inArabidopsis[J]. Plant Cell and Environment，2014，37(4)：852-863.

[19]Balk J，Lobreaux S. Biogenesis of iron-sulfur proteins in plants[J]. Trends in Plant Science，2005，10(7)：324-331.

[20]Ranieri A，Castagna A，Baldan B，et al. Iron deficiency differently affects peroxidase isoforms in sunflower[J]. Journal of Experiment Botany，2001，52(354)：25-35.

[21]高 麗，史衍璽. 鐵脅迫對花生某些生理特性的影響[J]. 中國油料作物學報，2003，25(3)：51-54.