珍稀樹種紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)的影響因素

桂 平，韋小麗，田雨風，蘇石誠，吳高殷

(1. 貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

【研究意義】紅豆樹(OrmosiahosieiHemsl et Wils)為蝶形花科紅豆樹屬樹種，為我國特有鄉(xiāng)土樹種，國家Ⅱ級重點保護珍貴樹種，被《中國物種紅色名錄》列為VU等級瀕危樹種[1-3]。由于紅豆樹生長緩慢，開花結(jié)實不穩(wěn)定，存在嚴重的大小年現(xiàn)象且繁殖困難[4]，加上無節(jié)制的砍伐，造成紅豆樹自然資源處于瀕臨滅絕狀態(tài)[1]。組織培養(yǎng)技術(shù)是目前繁殖速度最快、繁殖系數(shù)最高的技術(shù)，較適于珍稀瀕危樹種的繁殖[5]。【前人研究進展】關(guān)于紅豆樹組織培養(yǎng)已有報道，范輝華等[6]以紅豆樹根蘗苗莖段為外植體誘導(dǎo)植株再生，但誘導(dǎo)率不高且未形成完整植株；何碧珠等[7]以紅豆樹種子為外植體建立了組織培養(yǎng)體系；何官榕等[8]采用萌發(fā)種胚中子葉胚的2/3做外植體，誘導(dǎo)下胚軸潛伏芽萌發(fā)并形成完整植株?！颈狙芯壳腥朦c】關(guān)于紅豆樹不同外植體消毒方式和培養(yǎng)基營養(yǎng)條件、質(zhì)地及pH環(huán)境等的研究未見報道，因此，篩選其組織培養(yǎng)的最佳消毒方式、基本培養(yǎng)基種類、蔗糖和瓊脂濃度及pH等對加快紅豆樹的繁殖，提高其繁殖系數(shù)具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以紅豆樹幼嫩莖段為試材，采用單因素試驗探討其初代培養(yǎng)的影響因素，篩選最適的培養(yǎng)條件，為提高繁殖率，完善紅豆樹組織培養(yǎng)體系提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

表1 紅豆樹莖段個植體的消毒滅菌試驗設(shè)計

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 外植體 選取苗高≥12 cm的健壯紅豆樹幼苗，將植株從莖基部剪下并去掉葉片和頂芽備用。紅豆樹幼苗由貴州大學(xué)林學(xué)院提供。

1.1.2 試劑 MS、1/2MS、WPM及B5培養(yǎng)基自制，其藥品來源于海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；6-BA、NAA、蔗糖、瓊脂來源于北京solarbio公司；乙醇來源于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；0.1 %HgCl2來源于貴州銅仁，KMnO4來源于成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅菌 消毒方式設(shè)4個處理(表1)，將剪下的嫩莖用自來水沖洗1 h，分別按X1～X4的方式進行消毒處理。每處理期間用無菌水沖洗3～4次，將滅菌的嫩莖用消毒的濾紙吸干水分后剪切成1.0～1.5cm長(帶1～2個側(cè)芽)的莖段(下同)，接種于MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L培養(yǎng)基中，pH調(diào)至6.0，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種10～12瓶，每瓶接種1～2個外植體，每7 d觀察記錄1次外植體污染、死亡和生長情況，30 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.2.2 蔗糖濃度的篩選 將紅豆樹幼嫩莖以0.1 % KMnO410 min+75 %乙醇 30 s+0.1 % HgCl28 min方式消毒后剪切成1.0～1.5 cm長(帶1～2個芽)的莖段(以下同)，以MS為基本培養(yǎng)基，附加激素6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，瓊脂8 g/L，分別添加不同濃度的蔗糖，pH調(diào)至6.0。試驗設(shè)5個處理(Z1～Z5)，即在上述培養(yǎng)基中分別添加濃度為10、20、30、40和50 g/L的蔗糖。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種10瓶，每瓶接種2～4個外植體，每7 d觀察記錄1次外植體生長情況，60 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果。培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照強度3000 lx，光照時間為12 h/d(以下同)。

1.2.3 瓊脂濃度的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，附加激素6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，蔗糖30 g/L，分別添加不同濃度的瓊脂，pH調(diào)至6.0。試驗設(shè)5個處理(Q1～Q5)，即在上述培養(yǎng)基中分別添加濃度為6、7、8、9和10 g/L的瓊脂。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種10瓶，每瓶接種2個外植體，每7 d觀察記錄1次外植體生長情況，60 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.2.4 培養(yǎng)基pH的篩選 試驗設(shè)5個處理(P1～P5)，即將MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基pH分別調(diào)至5.6、5.8、6.0、6.2和6.5。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種10瓶，每瓶接種2個外植體，每7 d觀察記錄1次外植體的生長情況，60 d后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.5 基本培養(yǎng)基的篩選 試驗設(shè)4個處理(Y1～Y4)，即依次以MS、1/2MS、WPM和B5為基本培養(yǎng)基，其中添加激素6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L，pH調(diào)至6.0。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種20瓶，每瓶接種1～3個外植體，每7 d觀察記錄1次外植體誘導(dǎo)和生長情況，60 d后統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式紅豆樹莖段的生長情況

從表2和圖1可知，0.1 % HgCl2處理時間以8 min最好，處理時間過短，污染率較高，處理時間過長，雖然沒有污染，但外植體存在一定程度的損傷，死亡率達28.59 %且生長緩慢。用0.1 % KMnO4

表2 不同消毒方式紅豆樹莖段的污染率及成活率

注：同列不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP<0.01 andP<0.05 level respectively. The same as below.

表3 不同濃度蔗糖處理紅豆樹莖段的啟動培養(yǎng)狀況

預(yù)處理10 min可有效地降低外植體污染率，提高成活率。4個處理中，X4的成活率最高且生長情況最好，成活率為100 %。從外植體污染情況看，主要為細菌污染，菌落小、表面呈乳脂狀(圖1C～D)，存在少量的真菌污染，菌落表面多呈毛絨狀(圖1E)。經(jīng)方差分析，4個處理平均污染率差異極顯著(P<0.01)，平均成活率差異顯著(P<0.05)，其中，X4的平均污染率和成活率均與其余3個處理存在極顯著差異(P<0.01)；X3的平均死亡率與其余3個處理存在極顯著差異(P<0.01)。

2.2 不同濃度蔗糖對紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)的影響

由表3和圖2可以看出，不同濃度蔗糖對紅豆樹莖段誘導(dǎo)開始時間和生長表現(xiàn)影響較大。隨著蔗糖濃度的升高，紅豆樹莖段開始誘導(dǎo)時間逐漸提前，蔗糖濃度增至40 g/L(Z4)后開始誘導(dǎo)時間穩(wěn)定在第7天；蔗糖濃度越高，紅豆樹的誘導(dǎo)新芽越健壯且葉片越大，但褐化率逐漸升高，當蔗糖濃度增至50 g/L(Z5)時，苗高和葉片數(shù)均呈明顯下降趨勢且褐化率達100 %。經(jīng)方差分析，不同濃度蔗糖處理外植體誘導(dǎo)開始時間、平均幼芽高、葉片數(shù)和褐化率均存在極顯著差異(P<0.01)。從誘導(dǎo)開始時間、幼芽高、葉片數(shù)和生長情況看，最佳蔗糖濃度為40 g/L，但其褐化率較高，不利于后續(xù)的生長與分化。因此，紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)最佳的蔗糖濃度以30 g/L為宜。

2.3 不同濃度瓊脂對紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)的影響

從表4和圖3可知，不同質(zhì)地培養(yǎng)基中紅豆樹莖段誘導(dǎo)芽的生長存在差異，培養(yǎng)基太硬或太軟都不適宜外植體的誘導(dǎo)生長，均表現(xiàn)生長慢或緩慢。其中，Q3(瓊脂濃度為8 g/L時)的誘導(dǎo)芽生長健壯，其平均芽高和葉片數(shù)比Q1增加1.2 cm和3.34片，比Q5增加2.43 cm和6.34片。經(jīng)方差分析，Q3與Q2的平均芽高差異不顯著(P>0.05)，但與Q1差異顯著(P<0.05)，與Q4和Q5差異極顯著(P<0.01)；Q3與Q2平均葉片數(shù)差異不顯著(P>0.05)，但與Q1、Q4和Q5差異極顯著(P<0.01)。因此，紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)的最適瓊脂濃度為8 g/L。

A～B為未被污染正常生長的外植體；C～D為細菌污染；E為真菌污染A-B.Uncontaminated explants；C-D.An explant contaminated with bacterial； E.An explant contaminated with fungi圖1 滅菌紅豆樹莖段的生長狀況Fig.1 Growth status of sterilized Ormosia hosiei stem segments

A、B、C、D、E分別表示蔗糖濃度為10、20、30、40和50 g/L時紅豆樹莖段誘導(dǎo)芽的生長情況A，B，C，D and E presents growth status of buds induced from Ormosia hosiei stem segments under 10,20,30,40 and 50 g/L sucrose,respectively圖2 不同濃度蔗糖處理紅豆樹莖段誘導(dǎo)芽的生長Fig.2 Growth of buds induced from Ormosia hosiei stem segments under different sucrose concentration

A、B、C、D、E分別表示瓊脂濃度為6、7、8、9和10 g/L時紅豆樹莖段誘導(dǎo)的芽生長狀況A，B，C，D and E presents growth status of buds induced from Ormosia hosiei stem segments under 10,20，30,40 and 50 g/L agar,respectively圖3 不同濃度瓊脂處理紅豆樹叢生芽的生長狀況Fig.3 Growth of cluster buds induced from Ormosia hosiei stem segments under different agar concentration

2.4 不同pH對紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)的影響

由表5和圖4可見，不同pH培養(yǎng)基上紅豆樹莖段誘導(dǎo)叢生芽的平均芽高和葉片數(shù)差異極顯著(P<0.01)，生長差異也十分明顯。其中，P3和P4紅豆樹莖段誘導(dǎo)叢生芽生長較好，但在后期觀察到P4紅豆樹植株的葉片出現(xiàn)微黃現(xiàn)象；而P1和P5紅豆樹莖段誘導(dǎo)叢生芽的生長均不佳，表現(xiàn)生長緩慢，葉片細小，且P5還存在少量的玻璃化現(xiàn)象。因此，紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)的pH宜選擇6.0。

2.5 不同基本培養(yǎng)基對紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)的影響

從表6和圖5可知，通過60 d的培養(yǎng)各處理均能很好地誘導(dǎo)側(cè)芽的發(fā)生，但對叢生芽誘導(dǎo)率和芽的長勢存在很大差異。其中，Y2和Y3均能很好地誘導(dǎo)叢生芽的發(fā)生，但是Y3的叢生芽生長緩慢，60 d后平均芽高僅1.6 cm；Y1和Y4誘導(dǎo)的側(cè)芽長勢較好，芽苗較高，但叢生芽誘導(dǎo)率相對較低，存在不同程度的褐化現(xiàn)象。4個處理以Y2誘導(dǎo)的叢生芽最多、最健壯，且無褐化現(xiàn)象發(fā)生，為紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)最佳的基本培養(yǎng)基。經(jīng)方差分析，Y2與Y3

表4 不同濃度瓊脂處理紅豆樹莖段的啟動培養(yǎng)狀況

表5 不同pH處理紅豆樹莖段的啟動培養(yǎng)狀況

表6 不同基本培養(yǎng)基處理紅豆樹莖段的啟動培養(yǎng)狀況

的平均側(cè)芽誘導(dǎo)率、叢生芽誘導(dǎo)率差異不顯著(P>0.05)，但Y2和 Y3與 Y1和Y4間均存在極顯著差異(P<0.01)；Y2與Y1和Y4的平均芽數(shù)差異極顯著(P<0.01)；Y2與Y4的平均芽高差異不顯著(P>0.05)，但與Y1和Y3的差異分別達顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。

3 討 論

外植體滅菌，建立無菌體系是植物組織培養(yǎng)的第一步。HgCl2是一種極為有效的外植體殺菌劑，與乙醇配合使用效果更佳[9]。該研究得出，在用75 %乙醇處理30 s的前提下，隨著0.1 % HgCl2處理時間的增加，紅豆樹莖段污染率逐漸降低，但成活率呈先升后降趨勢，處理時間以8 min為宜，時間過長，外植體遭受一定程度的損傷，以致誘導(dǎo)受抑制。試驗還得出3種(0.1 % KMnO4+75 %乙醇+0.1 % HgCl2)滅菌劑組合滅菌效果優(yōu)于2種(75 %乙醇+0.1 % HgCl2)滅菌劑組合，與劉會超等[10-11]的研究結(jié)果類似。而用0.1 % KMnO4預(yù)處理10 min能有效提高外植體成活率，降低污染率，與段維興等[12]研究結(jié)果一致。

由于植物離體組織生長所需的營養(yǎng)成分全部來自培養(yǎng)基中，所以選擇合適的基本培養(yǎng)基是進行植株再生培養(yǎng)的基礎(chǔ)[13-14]。通常情況下，對叢生芽誘導(dǎo)全量MS培養(yǎng)基效果優(yōu)于1/2MS培養(yǎng)基[14]。本試驗得出，紅豆樹莖段叢生芽誘導(dǎo)最佳的基本培養(yǎng)基是1/2MS培養(yǎng)基，與何碧珠等[7]“1/2MS培養(yǎng)基不適于鄂西紅豆的種胚培養(yǎng)”的結(jié)論不一致，可能是各自采用的外植體不同，所需的培養(yǎng)基營養(yǎng)條件不同所致[15-21]。而降香黃檀莖段[22]、貫葉金絲桃嫩梢[23]、李砧木葉片[24]及山紅柿休眠芽[25]等植物外植體最佳啟動基本培養(yǎng)基均為1/2MS，與本研究紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)最佳基本培養(yǎng)基為1/2MS的結(jié)論一致。

A、B、C、D、E分別表示pH為5.6、5.8、6.0、6.2和6.5時紅豆樹莖段誘導(dǎo)的芽生長情況A，B，C，D and E presents growth status of buds induced from Ormosia hosiei stem segments at pH 5.6,pH 5.8,pH 6.0,pH 6.2 and pH 6.5,respectively圖4 不同pH處理紅豆樹莖段誘導(dǎo)叢生芽的生長Fig.4 Growth of cluster buds induced from Ormosia hosiei stem segments at different pH value

A、B、C和D分別表示MS、1/2MS、WPM和B5基本培養(yǎng)基中紅豆樹莖段誘導(dǎo)芽的生長狀況A，B，C and D presents growth status of buds induced from Ormosia hosiei stem segments cultured on MS,1/2MS,WPM and B5,respectively圖5 不同基本培養(yǎng)基處理紅豆樹莖段誘導(dǎo)叢生芽的生長狀況Fig.5 Growth of cluster buds induced from Ormosia hosiei stem segments cultured on different basic media

培養(yǎng)基的滲透壓、質(zhì)地和pH也是影響啟動培養(yǎng)效果的重要因素。糖類起到調(diào)節(jié)滲透壓的重要作用，是影響細胞分裂、分化和形態(tài)建成的重要因素[26-27]。該研究發(fā)現(xiàn)，隨著蔗糖濃度增加滲透壓越大，愈能促進細胞分裂及芽的誘導(dǎo)生長，其中，蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時紅豆樹莖段啟動培養(yǎng)效果最好。滲透壓過高，褐化越嚴重，導(dǎo)致紅豆樹莖段細胞分裂能力下降。培養(yǎng)基的瓊脂濃度直接影響培養(yǎng)基質(zhì)地和水分狀況，該研究發(fā)現(xiàn)瓊脂濃度過高與過低都不利于紅豆樹莖段芽的誘導(dǎo)和生長，其中瓊脂質(zhì)量濃度以8 g/L最佳，可能是因為瓊脂濃度過低，培養(yǎng)基凝固度不夠，濕度過大，不利于外植體基部進行有氧呼吸；而瓊脂濃度過高，培養(yǎng)基變硬，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)很難被吸收與利用，導(dǎo)致芽分化能力減弱，組培苗生長不良所致[28]。培養(yǎng)基的pH以6.0最適，過高和過低均顯著影響紅豆樹幼芽高的生長與葉片的分化，均表現(xiàn)出生長緩慢、細弱和發(fā)黃現(xiàn)象，且pH過高還存在少量玻璃化現(xiàn)象。與胡根長等[29]的研究結(jié)果一致。

紅豆樹莖段在培養(yǎng)過程中容易發(fā)生褐化現(xiàn)象。主要是由于外植體的分泌物被多酚氧化酶氧化后形成，導(dǎo)致褐化現(xiàn)象的原因除了外植體本身外，與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式有關(guān)系[30]。該研究只對外植體誘導(dǎo)適宜的滅菌方式、基本培養(yǎng)基、pH、瓊脂濃度和蔗糖濃度進行了探討，對于如何控制外植體褐化及提高增殖系數(shù)還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

紅豆樹莖段以0.1 % KMnO410 min+75 %乙醇30 s+0.1 % HgCl28 min消毒最好，污染率僅6.98 %，成活率達100 %。啟動培養(yǎng)條件以1/2MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+pH 6.0的效果最好，叢生芽誘導(dǎo)率達85.19 %。

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