陸地棉葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析

司愛君，楊維才，謝宗銘，田 琴，董永梅，李有忠，馬盼盼

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所/農(nóng)業(yè)部西北內(nèi)陸區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆兵團(tuán)棉花遺傳改良與高產(chǎn)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000；2.中國科學(xué)院遺傳發(fā)育學(xué)研究所，北京 100101；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，新疆 石河子 832000)

【研究意義】啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的“開關(guān)”，為基因準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄所必需。在以往的植物基因工程研究中，組成型啟動(dòng)子由于簡單方便而得到廣泛應(yīng)用。由于組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因在棉花的不同時(shí)期和不同部位均能表達(dá)，容易積累大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物，打破體內(nèi)原有代謝平衡，從而影響植物正常生長，使得遺傳改造的棉花農(nóng)藝性狀較差。謝德意[1]研究發(fā)現(xiàn)， CaMV 35S啟動(dòng)子組成型表達(dá)，可能會(huì)降低棉株體內(nèi)殺蟲物質(zhì)的濃度，同時(shí)還消耗棉株大量能量，影響其殺蟲效果。侯丙凱等[2]研究發(fā)現(xiàn)，CaMV 35S組成型啟動(dòng)子使得抗蟲基因在棉花生長發(fā)育全周期及各組織中都存在，在這樣長期選擇壓力下，將會(huì)大大提高昆蟲對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生抗性的幾率。隨著Tail-PCR、Site Finding-PCR等克隆基因未知側(cè)翼序列技術(shù)的發(fā)展[3-4]，更多的組織特異型和誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子也逐漸應(yīng)用到基因工程研究中[5-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】宋陽等[8]克隆了一個(gè)大豆豆莢特異性啟動(dòng)子PSP， 在轉(zhuǎn)基因煙草的花莢中檢測到GUS高水平表達(dá)。張利東等[9]將GOS2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化水稻驗(yàn)證其在其在水稻中的組織表達(dá)特性。余艷等[10]利用水稻基因芯片篩選到1個(gè)全新的葉片特異性不表達(dá)的啟動(dòng)子，并通過GUS組織化學(xué)染色分析驗(yàn)證其功能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然已有不同來源的組織特異性啟動(dòng)子被研究利用，但在棉花中的報(bào)道相對較少[11-13]。本研究從陸地棉(GossypiumhirsutumL.)Coker 312中篩選出一個(gè)葉片特異性表達(dá)基因(Ghi.10424)，同時(shí)采用染色體步移法分離該基因上游的啟動(dòng)子序列LSP (leaf specific promoter)，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建的Ghlsp啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，驗(yàn)證啟動(dòng)子的組織表達(dá)特異性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為其進(jìn)一步應(yīng)用于棉花分子改良育種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為陸地棉Coker 312，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室提供，并由新疆農(nóng)科學(xué)院棉花研究所保存。實(shí)驗(yàn)材料選取生長15 d左右的棉花幼苗，采用CTAB/酸酚法分別提取棉花的根、莖和真葉的總RNA[14]，交由博奧生物有限公司完成基因表達(dá)譜芯片，其余用來合成cDNA進(jìn)行基因的組織特異性分析以及全長擴(kuò)增和序列測定。

1.2 試劑、質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、植物表達(dá)載體pPZP111，農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室提供。Genome Walking Kit (D316)、克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、TaqDNA聚合酶購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司，限制性內(nèi)切酶與T4DNA ligase 購自Fermentas公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。引物合成、測序均由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 棉花基因組DNA的提取 以棉花的幼葉為材料提取DNA，采用改良的CTAB法[15]。

1.3.2 陸地棉葉片特異表達(dá)基因的篩選及擴(kuò)增 以陸地棉基因表達(dá)譜芯片為參考，初步篩選出一個(gè)葉片特異性表達(dá)的基因Ghi.10424。將此表達(dá)序列標(biāo)簽ESTs(expressed sequence tags)序列在NCBI上Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，搜索UNIGENE數(shù)據(jù)庫對相似序列進(jìn)行聚類，將兩端含有重疊序列的ESTs組裝成一個(gè)疊連群進(jìn)行電子拼接裝配，得到一條完整的cDNA序列。根據(jù)Lasergene軟件搜索基因開放閱讀框ORF(Open Reading Frame)，并通過同源基因在蛋白水平上的比對以及基因是否含有上游非編碼區(qū)特有序列、編碼框下游是否有polyA加尾信號等，以此判定所得cDNA序列即為基因全長。根據(jù)電子拼接序列設(shè)計(jì)引物10424-F1及10424-R1(表1)進(jìn)行半定量RT-PCR分析，以棉花肌動(dòng)蛋白Actin為內(nèi)參基因，引物為已發(fā)表Pactin-F、Pactin-R[16]；并根據(jù)該基因的最大開放閱讀框(ORF)設(shè)計(jì)引物10424-F及10424-R進(jìn)行基因全長擴(kuò)增。

1.3.3 Genome walking法擴(kuò)增GhLsp啟動(dòng)子序列 利用基因特異性引物從基因組DNA中擴(kuò)增GhLsp進(jìn)行序列測定，并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)證的已知序列區(qū)(最好不少于500 bp)依次設(shè)計(jì)從3′端到5′端的3條特異性引物：SP1、SP2、SP3(表1)。由于一次擴(kuò)增得不到啟動(dòng)子全長，還需根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果設(shè)計(jì)引物，朝3′端方向繼續(xù)擴(kuò)增，因此又分別設(shè)計(jì)了第2輪及第3輪擴(kuò)增的SP1、SP2、SP3特異性引物。將3輪擴(kuò)增所得序列用DNAstar軟件進(jìn)行拼接和組裝獲得啟動(dòng)子全長序列，設(shè)計(jì)引物GhLsp-F、GhLsp-R1 與GhLsp-R2，并在上下游引物中分別引入PstI /XbaI酶切位點(diǎn)。

染色體步移法具體操作步驟參照TaKaRa公司的Genome Walking Kit說明書，根據(jù)具體情況略有變動(dòng)。以基因組DNA為模板，用AP1、AP2、AP3及AP4 Primer分別與特異性SP1 Primer進(jìn)行第1輪PCR；將1stPCR反應(yīng)液稀釋100倍后，取1 μl作為2ndPCR反應(yīng)的模板，分別以AP1、AP2、AP3、AP4 Primer為上游引物，SP2 Primer為下游引物，進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)。將2ndPCR反應(yīng)液稀釋100倍后，取1 μl作為3rdPCR反應(yīng)的模板，分別以AP1、AP2、AP3、AP4 Primer為上游引物，SP3 Primer為下游引物，進(jìn)行第3輪PCR反應(yīng)。用高保真酶KOD FX(TOYOBO)進(jìn)行啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接到pMD 18T(TaKaRa)載體并測序驗(yàn)證。對測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，命名pMD 18T-GhLsp。高保真酶KOD FX(TOYOBO)擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×PCR Buffer 25 μl；2 mmol·L-1dNTPs 10 μl；KOD FX 1 μl；模板1 μl；正反向引物各1 μl，補(bǔ)充水至50 μl。反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；58 ℃ 30 s；68 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min。

表1 本研究所用的引物

1.3.4 葉片特異性表達(dá)載體Ppzp111-Ghlsp構(gòu)建及植物轉(zhuǎn)化 用引物GhLsp-F分別與GhLsp-R1和GhLsp-R2組合，從棉花C312的DNA基因組中擴(kuò)增10424啟動(dòng)子。GhLsp1為包含ATG后42 bp的啟動(dòng)子序列，GhLsp2為不含ATG的啟動(dòng)子序列。用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I將GUS及NOS片段從植物表達(dá)載體pBI121上切下，同時(shí)雙酶切植物表達(dá)載體pPZP111，用T4DNA連接酶將GUS及NOS片段連接至pPZP111載體，獲得改造質(zhì)粒載體pPZP111-GUS。再用PstI、xbaI雙酶切載體 pPZP111-GUS和重組pMD 18T-GhLsp，分別將2個(gè)promoter片段和質(zhì)粒載體pPZP111-GUS大片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并鑒定陽性克隆，從而最終獲得葉片特異性表達(dá)載體pPZP111-Ghlsp(圖1)。利用凍融法將pPZP111-Ghlsp載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥col生態(tài)型，同時(shí)將植物表達(dá)載體pBI121轉(zhuǎn)化擬南芥作為陽性對照。

1.3.5 陸地棉GhLsp啟動(dòng)子的GUS活性分析 將經(jīng)過卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代移栽蛭石中培養(yǎng)，隨機(jī)取T1代植株的花序、角果用于GUS組織化學(xué)染色分析；分別取生長10與30 d的T2代轉(zhuǎn)基因幼苗用于GUS組織化學(xué)染色分析，方法參照[17]。將植物材料置于含有X-Gluc反應(yīng)液(50 mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.0；0.5 mmol/L K3[Fe( CN)6]；0.5 mmol/L K4[Fe(CN)6]；10 mmol/L EDTA ；0.1 % Triton X-100；2 mmol/L X-gluc)的離心管中，抽真空20 min，37 ℃染色0.5 h，最后用70 %乙醇脫色，然后觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片特異表達(dá)基因的篩選及基因擴(kuò)增

通過對棉花葉片、根、莖cDNA進(jìn)行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)Ghi.10424基因在葉片中表達(dá)量較高，在莖段有少量表達(dá)，在根部幾乎不表達(dá)(圖2)；在NaCl的脅迫下Ghi.10424基因表達(dá)量較弱，隨著時(shí)間的延長表達(dá)量逐漸降低，12 h后達(dá)到最高值；在PEG6000的處理下幾乎看不到其表達(dá)，由此說明Ghi.10424為葉片特異性表達(dá)基因。

圖1 表達(dá)載體pPZP111-Ghlsp的構(gòu)建Fig.1 Construction of the expression vector pPZP111-Ghlsp

R: 根; S: 莖; L: 葉R: Root; S: Stem; L: Leaf圖2 Ghi.10424基因不同組織的半定量RT-PCR檢測Fig.2 Semi-quantitative analysis of Ghi.10424 under different tissues

圖3 NaCl(200 μM)脅迫下Ghi.10424基因的半定量RT-PCR檢測(h)Fig.3 Semi-quantitative analysis of Ghi.10424 under NaCl treatment of different period

2.2 陸地棉GhLsp啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增

將第三輪PCR反應(yīng)結(jié)束后的產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖5。啟動(dòng)子第1輪擴(kuò)增得到1.5 kb(圖5A)，啟動(dòng)子第2輪擴(kuò)增得到400 bp(圖5B)，啟動(dòng)子第3輪擴(kuò)增得到700 bp(圖5C)。將3輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行拼接并除去重疊DNA序列，3輪擴(kuò)增得到啟動(dòng)子序列總長度約2 kb(圖5D)。

圖4 PEG6000處理下Ghi.10424基因不同時(shí)期的半定量RT-PCR檢測(h)Fig.4 Semi-quantitative analysis of Ghi.10424 under PEG6000 treatment of different period

2.3 陸地棉GhLsp啟動(dòng)子的序列分析

運(yùn)用PlantCARE在線分析軟件查找GhLsp啟動(dòng)子序列的重要順式作用元件和葉片特異表達(dá)的序列，結(jié)果表明：GhLsp啟動(dòng)子序列具有典型的TATA框和CAAT框，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-145和-182 bp處(圖7與表2)。啟動(dòng)子序列除了含有核心元件及順式元件外，還存在光反應(yīng)元件、低溫誘導(dǎo)元件、MYB干旱誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)等多個(gè)特異性作用元件。

A：啟動(dòng)子第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DNA marker 2000；2：PCR第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物1.5 kb；B：啟動(dòng)子第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物；M：DNA marker 2000；1～3：PCR第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物400 bp；4～5：PCR第3輪AP2引物擴(kuò)增產(chǎn)物；C：啟動(dòng)子擴(kuò)增第3輪產(chǎn)物；M: DNA marker 2000；1～2：PCR第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物1.0 kb；D：啟動(dòng)子全長擴(kuò)增；M：DNA marker 2000；1～3：啟動(dòng)子全長擴(kuò)增到產(chǎn)物2.1 kbA: Promoter product for the first round; M: DNA marker 2000; 2: PCR product of the 3rd round；B: Promoter product for the second round; M: DNA marker 2000; 1-3: PCR product for the 3rd round；C: Promoter product for the third round; M: DNA marker 2000; 1-2: The 3rd round of PCR product；D: The full-length of promoter; M: DNA marker 2000; 2: The full-length of promoter product圖5 GhLsp啟動(dòng)子的擴(kuò)增Fig.5 Cloning of GhLsp promoter

圖6 經(jīng)過3次染色體步移獲得GhLsp啟動(dòng)子序列Fig.6 Succeeded in getting the GhLsp promoter after three times of genome walking

2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將擴(kuò)增啟動(dòng)子片段GhLsp1、GhLsp2分別連接中間載體pPZP111-GUS后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測及酶切鑒定，限制性內(nèi)切酶BamHI/EcoRI雙酶切片段與目標(biāo)片段大小一致(圖8)，獲得葉片特異性植物表達(dá)載體pPZP111-Ghlsp1及pPZP111-Ghlsp2。

2.5 陸地棉GhLsp啟動(dòng)子的GUS活性分析

將試驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)化Ghlsp啟動(dòng)子的擬南芥種子進(jìn)行卡那霉素篩選，隨機(jī)取T1代植株經(jīng)過組織化學(xué)GUS染色發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化Ghlsp啟動(dòng)子的擬南芥僅葉片顯示明顯藍(lán)色，而其他部位幾乎不顯色，但陽性對照的野生型擬南芥的葉片、莖、根部、花、角果等均被染成藍(lán)色(圖9)，說明Ghlsp啟動(dòng)子特異性地啟動(dòng)GUS基因在葉片中表達(dá)。

3 討 論

近年來，從擬南芥、水稻、馬鈴薯等植物中已克隆很多組織特異表達(dá)啟動(dòng)子，可以有目的地提高轉(zhuǎn)基因植物特定組織的基因表達(dá)量進(jìn)而改善其品質(zhì)。顏彥[18]從水稻中獲得一個(gè)綠色組織特異表達(dá)啟動(dòng)子GSP，并通過缺失載體的構(gòu)建鑒定出啟動(dòng)子核心區(qū)域；郭燕[19]從擬南芥基因組中篩選出1個(gè)葉片特異性表達(dá)和2個(gè)角果特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，并轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證其功能；瞿韻[20]從馬鈴薯中分離出一個(gè)光誘導(dǎo)型莖葉特異表達(dá)啟動(dòng)子。雖然人們一直沒有停止對新型啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)和探索，但已有的研究大都局限于擬南芥、水稻等模式植物，而在重要經(jīng)濟(jì)作物棉花中卻研究的相對較少。劉峰[12]從新陸早33號中獲得Lea(Late embryogenesis abundant)基因的種子特異性啟動(dòng)子，實(shí)驗(yàn)證明其驅(qū)動(dòng)GUS基因在種子中特異表達(dá)；王芳[13]通過轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS表達(dá)分析證明棉花α球蛋白A基因啟動(dòng)子是一個(gè)種子特異性啟動(dòng)子；琦明玉[11]從亞洲棉中克隆了Lea蛋白基因D113、D34基因的啟動(dòng)子，生物信息學(xué)分析證明該啟動(dòng)子具有較高種子特異性。綜上所述，在棉花基因工程研究中越來越多的棉花內(nèi)源啟動(dòng)子被開發(fā)出來，但關(guān)于棉花葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子的研究，有關(guān)的報(bào)道相對較少。棉花葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官，在能量的固定和利用中起著十分重要的作用，葉片特異性啟動(dòng)子可以使基因表達(dá)產(chǎn)物富集在葉片中，增加目的基因在葉片中的表達(dá)量，不僅可以減少棉花無需的物質(zhì)能量消耗，有效改善光合作用，而且可以有目的地改良棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量。

圖7 GhLsp啟動(dòng)子序列的分析Fig.7 The sequence analysis of GhLsp promoter

元件名稱Component name保守序列Conserved sequence生物學(xué)功能Biological function位置Location來源SourceGT1-motifAATCCACA光反應(yīng)元件-835馬鈴薯Solanum tuberosumLTRCCGAAA順式作用低溫響應(yīng)元件-454大麥Hordeum vulgareMRSTAACTGMYB干旱誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)-1414擬南芥Arabidopsis thalianaBox4ATTAAT光響應(yīng)DNA模塊部分-1317香芹Petroselinum crispumG-BoxCACGTA順式作用光反應(yīng)元件-1144金魚草Antirrhinum majusCAAT-boxCAAT順式作用元件-182大麥Hordeum vulgareTATA-boxTATA核心元件-145擬南芥Arabidopisis thaliana

A：pPZP111中間載體的構(gòu)建；M：DNA marker 2000；1～5：轉(zhuǎn)化質(zhì)粒BamHI/EcoRI雙酶切。B：葉片特異性表達(dá)載體的構(gòu)建；M：DNA marker 2000；1～5：轉(zhuǎn)化質(zhì)粒PstI/xbaI雙酶切A: Construction of pPZP111 intermediate vector; M: DNA marker 2000; 1-5: double digestion of BamHI / EcoRI for transformed plasmid.B: Construction of leaf-specific expression vector; M: DNA marker 2000; 1-5: double digestion of PstI / xbaI for for transformed plasmid圖8 植物表達(dá)載體pPZP111的構(gòu)建Fig.8 The construction of plant expression vector pPZP111

A.幼苗期擬南芥GUS組織染色分析；B.蓮座期擬南芥GUS組織染色分析；C.擬南芥的角果與花的GUS組織染色分析A.GUS staining analyisis of Arabidopsis thaliana in seedling stage；B.GUS staining analyisis of Arabidopsis thaliana in rosette stage；C.GUS staining analyisis of silique and flower in Arabidopsis thaliana圖9 GUS活性的組織染色分析Fig.9 Tissure staining analysis of GUS activity

4 結(jié) 論

本研究從陸地棉(GossypiumhirsutumL.)Coker 312克隆了1個(gè)葉片特異表達(dá)啟動(dòng)子序列，命名為LSP (leaf specific promoter)，通過轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行GUS活性染色分析證實(shí)GhLsp特異性在葉片中表達(dá)。PlantCARE在線分析表明，GhLsp啟動(dòng)子序列除了含有核心元件及順式元件外，還存在光反應(yīng)元件、低溫誘導(dǎo)元件及MYB干旱誘導(dǎo)結(jié)合位點(diǎn)等多個(gè)特異性作用元件。作為起重要調(diào)控作用的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子，這一類啟動(dòng)子在生物反應(yīng)器的研發(fā)以及在抗蟲、抗病、抗旱、抗高滲脅迫等抗逆特性的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)良品種選育等方面具有很大潛力，能使得外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)、定量三維精確調(diào)控，可通過利用棉花內(nèi)源啟動(dòng)子本身的特性，進(jìn)而啟動(dòng)耐旱、抗蟲等改良基因在棉花中的高效表達(dá)。本研究為外源基因在棉花葉片中的定位表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)，不僅在改良棉花性狀的同時(shí)減少對棉花生理方面的副作用，而且為今后棉花分子育種及相關(guān)啟動(dòng)子的開發(fā)與篩選提供了一種可行的方法和新的視野，將在棉花抗逆轉(zhuǎn)基因育種中將會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]謝德意. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉研究進(jìn)展、問題及對策[J].中國棉花,2001,28(2):6-8.

[2]侯丙凱,陳正華. 植物抗蟲基因工程研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)2000,17(5):385-393

[3]Liu Y G, Whittier R F. Thermal asymmetric interlaced PCR:automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking[J]. Genomics. 1995, 25(3):674-81.

[4]Tan G H, Gao Y, Shi,M ,et al. SiteFinding-PCR: a simple and efficient PCR method for chromosome walking[J]. Nucleic Acids Research, 2005, 33(13 ): e122.

[5]包秋華,王 磊,牛一丁,等. 甜瓜黃瓜素基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建及分析[J].西北植物學(xué)報(bào), 2011,31(11): 2153-2157.

[6]張金輝,龍 海,鄧光兵,潘志芬,余懋群.水稻花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆與活性檢測[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2008,14(3): 328-331.

[7]王奇峰, 胡清泉, 趙 玥,等. 光誘導(dǎo)和組成型啟動(dòng)子控制檸檬酸合酶基因過量表達(dá)對轉(zhuǎn)基因煙草耐鋁性影響的比較[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2011, 37(1):31-39.

[8]宋 陽,王丕武,張學(xué)明,等. 大豆豆莢特異性啟動(dòng)子的克隆及功能分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014(10):63-69.

[9]張利東,朱 騫,董陳文華,等.水稻GOS2基因高活性啟動(dòng)子的分離及其在葉片中的特性鑒定[J].分子植物育種,2015,13(1):32-38.

[10]余 艷, Pedro, S.C.F.Rocha,等.水稻葉片特異性不表達(dá)啟動(dòng)子pOsMTG3的克隆與表達(dá)分析[J].雜交水稻, 2016(1):45-50.

[11]琦明玉,陸才瑞,鄒長松,等.棉花種子特異性啟動(dòng)子的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 棉花學(xué)報(bào)2011,23(5):427-432.

[12]劉 峰, 汪小東, 趙彥鵬,等. 棉花種子特異表達(dá)的LEA啟動(dòng)子克隆及功能驗(yàn)證[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2014, 26(4):310-317.

[13]王 芳, 魏琦超, 張 銳,等. 棉花種子特異表達(dá)α球蛋白A基因啟動(dòng)子的功能分析[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2016, 28(3):189-198.

[14]宋國立，崔榮霞，王坤波，等．改良CTAB法快速提取棉花DNA[J]．棉花學(xué)報(bào)，1998，10(5)：273-275．

[15]蔣建雄,張?zhí)煺?利用CTAB/酸酚法提取棉花組織總RNA[J].棉花學(xué)報(bào),2003,15(3):166-167.

[16]Jie-Yin Chen, Xiao-Feng Dai.Cloning and characterization of the Gossypium hirsutum major latex protein gene and functional analysis in Arabidopsis thaliana[J]. Planta, 2010, 231(4):861-873.

[17]Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants:The GUS gene fusion system. Experimental protocols[J]. Plant Mol Biol Re,1987, 5:387-405.

[18]顏 彥,林擁軍.一個(gè)水稻鞘葉特異表達(dá)啟動(dòng)子的克隆及功能鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2013, 21(7): 757-763

[19]郭 燕,詹高森,楊曉燕,華瑋,呂應(yīng)堂.擬南芥葉片和角果特異性啟動(dòng)子的篩選與分析[J].中國油料作物學(xué),2015,37(1);001-008.

[20]瞿 韻,張 寧,常 璟,等.馬鈴薯光誘導(dǎo)型莖葉特異表達(dá)啟動(dòng)子ST-LS 1的克隆與功能分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2013,21(7): 828-837.

[21]曾小林,劉傳亮,張朝軍,等.啟動(dòng)子在棉花基因工程中的應(yīng)用與研發(fā)[J].分子植物育種,2009,7(6):1193-1199.

[22]CUMMINS J,Ho M W,Ryan A,et al.Hazardous CaMV promoter[J].Nature Biotechnol,2000,18(4):363.

[23]王 淼, 王旭靜, 唐巧玲,等. 高等植物綠色組織特異表達(dá)啟動(dòng)子研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào), 2010, 12(2):33-37.