靶向HSP90抑制劑
——VER-52296在嗜鉻細胞瘤細胞系PC12中的作用及其機制

徐飛飛 林登強 孟立 蔣文 徐云澤 廉建坡 汪成合 何竑超 祝宇

嗜鉻細胞瘤(pheochromocytomas，PCCs)是一種腎上腺髓質(zhì)和腎上腺外交感神經(jīng)系統(tǒng)來源的腫瘤，人群的散發(fā)病例為2～8人次/100萬。腎上腺PCCs主要發(fā)生于腎上腺髓質(zhì)，有10%～20%的神經(jīng)瘤起源于交感神經(jīng)節(jié)，故亦稱為副神經(jīng)節(jié)瘤[1]。PCCs中約10%為惡性PCCs，目前，臨床上對于惡性PCCs的治療手段非常有限，外科手術(shù)依然是治療惡性PCCs的主要方法，但仍然很難達到治愈的目標[2]。分子靶向治療是惡性PCCs治療的發(fā)展趨勢，靶向治療是目前的研究熱點。在多種腫瘤的生長過程中，熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)的抗凋亡作用對其腫瘤的形成以及轉(zhuǎn)移起到了極其重要的作用，故對腫瘤的HSP90的靶點抑制可作為干擾腫瘤生長的重要方式[3-6]。

HSP90是一類廣泛存在于細胞中的分子伴侶蛋白，參與多種蛋白的正確折疊，從而維持其結(jié)合的客戶蛋白結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定[7-9]。其部分客戶蛋白，如：PI3K/AKT通路的蛋白及在MEK/ERK通路中的蛋白，與腫瘤的增殖、凋亡和腫瘤的轉(zhuǎn)移等腫瘤相關(guān)事件相關(guān)。動物實驗和臨床前實驗證實，靶向抑制腫瘤細胞HSP90蛋白可以抑制甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。HSP90有望成為一個非常有潛力的惡性PCCs的治療靶點。 VER-52296是第二代HSP90抑制劑，為三唑雜環(huán)酮型小分子化合物，安全性高且療效好，對腫瘤細胞的抑制作用相較于其他HSP90抑制劑更為有效和安全。PC12細胞來自成年大鼠腎上腺髓質(zhì)的PCCs細胞系，通常有未分化型和分化型兩種類型，未分化型其細胞多呈圓形傾向于聚成小團簇狀；分化型則細胞體積大，突觸較長較多，形成網(wǎng)絡(luò)，類似交感神經(jīng)元樣的分化。因分化型的PC12細胞與人PCCs細胞形態(tài)和生物學特性相似，本研究選擇了分化型PC12細胞。本實驗分析研究了 VER-52296對PC12細胞的細胞增殖、細胞周期、凋亡和遷移能力的影響，以及與其相關(guān)的信號通路的調(diào)節(jié)機制，從而探討 VER-52296對治療惡性PCCs的可能性。

材料與方法

一、材料

大鼠PCCs細胞PC12購自中科院上海細胞庫；HSP90抑制劑購自美國Selleck公司；Anti-HSP70、anti-PI3K、anti-AKT、anti-MEK、anti-ERK、anti-ACTIN均購自Cell Signaling TECHNOLOGY公司；細胞周期與凋亡試劑盒購自美國BD公司；胎牛血清、馬血清購自美國Gibco公司。

二、細胞培養(yǎng)

在5%(體積分數(shù))CO2恒溫孵育箱中進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)液含10%馬血清、5%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)、1%(體積分數(shù))雙抗，每3 d換液或傳代一次。其后將PC12細胞接種于96孔板(CCK8)或6 cm培養(yǎng)皿(流式細胞儀或蛋白質(zhì)檢測)，細胞密度70%～80%用于實驗。

三、CCK8法測定細胞存活率

實驗分為空白組、對照組和實驗組3組。取處于對數(shù)生長期的PC12細胞制成5×104/ml細胞懸液，以每孔100 μl接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，其后分別加入含不同終濃度 VER-52296的培養(yǎng)液(10、25、50、100、200 nmol/L)?？瞻捉M只加培養(yǎng)液不加細胞，對照組每孔加入100 μl細胞懸液，實驗組加入不同終濃度的 VER-52296。96孔板四周加入PBS填充，每孔設(shè)5個復(fù)孔。然后分別于用藥后24、48、72 h加入10% CCK8溶液10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，搖床上搖勻10 min后用酶標儀檢測其在570 nm吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次，按以下公式計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=1-(實驗組A-空白組A)/(陰性組A-空白組A)×100%。

四、細胞周期檢測

收集實驗處理過的對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化離心后，重懸制成單細胞懸液(每管至少2×105個細胞)，1 000 rpm離心5 min，棄去上清后，用PBS溶液清洗1次，在離心管中留約0.5 ml PBS，加入70%冰乙醇5 ml混勻固定，4 ℃ 放置48 h以上。檢測時，離心去乙醇，PBS清洗1次，在離心管中留1 ml PBS，打散細胞團，加入Rnase 5 μl(10 g/L)，37 ℃ 放置1 h，加入PI(0.1 g/L)染液，室溫避光染色30 min，計數(shù)10 000個細胞，流式細胞儀檢測細胞周期時相。

五、細胞遷移實驗

取對數(shù)生長期的PC12細胞，于無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后常規(guī)消化，用無血清DMEM制成單細胞懸液，以2×105個細胞/孔濃度加入Transwell小室，上室加入小劑量 VER-52296，作為實驗組。在下室加入500 μl含有10% FBS的完全培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)8 h后，用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察并計數(shù)。

六、Western blot

收集處理后的細胞，用PBS緩沖液清洗細胞2遍，加入RIPA、PMSF和Cocktail(體積比100∶1∶10)，超聲裂解細胞，于冰上裂解30 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min，收集上清液，定量后用4×Loading buffer稀釋煮沸，-20 ℃保存。定量用BSA法測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度，按30 μg/孔上樣，取蛋白樣品于10% SDS-PAGE中電泳，轉(zhuǎn)膜后在3% BSA中室溫下封閉l h，加一抗HSP70(1∶1 000)，AKT(1∶1 000)、P-AKT(1∶1 000)、MEK和ERK (1∶1 000)、P-MEK和P-ERK(1∶1 000)。TBST洗滌3次后與3% BSA稀釋的相應(yīng)二抗(1∶20 000)作用1 h，使用Image Lab軟件進行顯影。

七、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、VER-52296對PC12細胞增殖的抑制作用

CCK8法檢測結(jié)果表明48 h半數(shù)抑制濃度(IC50)為75 nmol/L，72 h IC50為30 nmol/L，在10～200 nmol/L濃度范圍內(nèi)有顯著的增殖抑制作用，VER-52296在200 nmol/L濃度范圍內(nèi)，72 h時間范圍內(nèi)，呈劑量-時間依賴性抑制腫瘤細胞的增殖，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 VER-52296對PC12細胞增殖的抑制作用

二、VER-52296對PC12細胞遷移的影響

小劑量VER-52296(150 nmol/L)作用于PC12細胞8 h后，可明顯抑制PC12細胞的遷移能力，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

A:實驗結(jié)果統(tǒng)計;B:對照組;C:實驗組

圖2 對照組與實驗組PC12細胞遷移數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色，×200)

三、VER-52296對PC12細胞周期的影響

以不同濃度 VER-52296作用于PC12細胞，24 h 后流式細胞儀測定其細胞周期。結(jié)果顯示，與對照組相比，100、200、400 nmol/L濃度組G2期細胞明顯增加，G1期細胞明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在一定濃度范圍內(nèi)相應(yīng)增加 VER-52296的劑量可使PC12細胞周期阻滯相對更加明顯(圖3)。

圖3 細胞周期分析

四、細胞凋亡的影響

應(yīng)用Annexin V-PI試劑盒檢測 VER-52296對PC12細胞的凋亡誘導作用，結(jié)果顯示， VER-52296處理PC12細胞48 h后，PC12細胞的早期凋亡細胞比例明顯增加，且有劑量依賴性，各不同劑量組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(圖4)。

A:實驗結(jié)果統(tǒng)計;B:實驗結(jié)果圖

圖4 細胞凋亡分析

五、HSP70、AKT、MEK、ERK、P-AKT、P-MEK及P-ERK蛋白水平

小劑量 VER-52296作用于細胞24 h后，可使HSP70蛋白表達明顯增加，使P-AKT、P-MEK、P-ERK的表達明顯降低，各組與未處理組相比均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而對于AKT、MEK、ERK等的下調(diào)作用并不明顯。HSP70水平上調(diào)，兩條通路的磷酸化部分水平上調(diào)，但是總蛋白水平?jīng)]有明顯的變化(圖5)。

圖5 HSP70、PI3K-AKT和MEK/ERK信號通路蛋白水平

討 論

目前，臨床上對惡性PCCs的治療方案非常有限，主要是由于該病的發(fā)病率低，發(fā)病機制復(fù)雜。同樣不容樂觀的是，很少有細胞毒性藥物用于治療惡性PCCs。細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的異常調(diào)節(jié)與多種腫瘤的發(fā)生、進展有著不可忽視的關(guān)系。多年來，人們通過對細胞信號轉(zhuǎn)導通路的不斷研究，發(fā)現(xiàn)多種信號通路轉(zhuǎn)導蛋白、生長因子及其受體在惡性PCCs中過度表達，表明這些因素可能與惡性PCCs的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。HSP90目前已被證實與多種蛋白的成熟與穩(wěn)定折疊相關(guān)，而這些蛋白對于腫瘤細胞的生長與轉(zhuǎn)移非常關(guān)鍵，因此，HSP90有可能成為對于腫瘤治療非常有潛力的一個靶點[6,11]。格爾德霉素(17-AAG)是近些年來癌癥治療中研究最為廣泛的一個HSP90抑制劑。然而，其在臨床上的應(yīng)用因嚴重的肝毒性及與細胞治療效果抵抗等不良反應(yīng)而受到限制[11-13]?；谙嚓P(guān)研究，我們猜測， VER-52296可以作為一種對腫瘤細胞有毒性，同時又能避免17-AAG藥物不良反應(yīng)的一種更好的小分子抑制劑[13]。VER52296主要是通過與HSP90蛋白的N端結(jié)構(gòu)域相結(jié)合而抑制HSP90蛋白的活性，促使其客戶蛋白的活性下降而產(chǎn)生抗腫瘤的效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，VER-52296能有效抑制腫瘤的生長，且在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出對惡性PCCs的誘導凋亡效果。因此，我們認為， VER-52296對于治療惡性PCCs，不論是在單獨用藥還是與其他藥物聯(lián)用，都將成為一個非常合理有效的治療選擇。

然而，HSP90在進化上是一種高度保守的分子伴侶蛋白，能夠調(diào)控其客戶蛋白的正確折疊及保持其成熟結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。已經(jīng)報道的HSP90的客戶蛋白種類超過200種，涵蓋了多種蛋白激酶、部分類固醇激素受體等[14]。在多種腫瘤細胞中，HSP90能夠調(diào)節(jié)異常折疊的癌基因相關(guān)蛋白，以維持該類蛋白的功能，從而引起腫瘤的性質(zhì)發(fā)生改變。關(guān)于HSP90的客戶蛋白，如AKT、PKC、PDK-1等的研究，均有提及HSP90參與了腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等細胞行為表現(xiàn)過程[15-16]。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，HSP90在惡性PCCs組織中表達異常增高，提示HSP90通路的異常上調(diào)可能與腫瘤新生血管形成及惡性PCCs的發(fā)生、發(fā)展及遠處轉(zhuǎn)移機制有關(guān)。故應(yīng)用特異性HSP90抑制劑，可能影響到腫瘤細胞中多個信號轉(zhuǎn)導通路，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的生長周期、凋亡、遷移侵襲等方面產(chǎn)生抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)， VER-52296可顯著抑制PC12細胞的增殖和遷移，且有時間和劑量依賴性。同時發(fā)現(xiàn)暴露于 VER-52296的細胞中出現(xiàn)了呈劑量依賴的腫瘤細胞誘導凋亡和細胞周期阻滯。

我們推測，VER-52296可能是通過HSP90特異相關(guān)的客戶蛋白的磷酸化失活從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，故我們在研究中評估了PI3K/AKT信號通路和MEK/ERK信號通路，這兩條通路與腎上腺PCCs的疾病進展均密切相關(guān)[17]。首先，我們評估了HSP70蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)HSP70暴露于 VER-52296 24 h后，表現(xiàn)出一種與劑量依賴的表達水平上調(diào)的關(guān)系，而HSP70水平上調(diào)正是HSP90抑制有效的一個典型標志。與HSP70上調(diào)形成鮮明反差的是,暴露于 VER-52296后，磷酸化的AKT、MEK、ERK出現(xiàn)了明顯的下調(diào)，同時，這3個信號蛋白的總蛋白的表達并未出現(xiàn)明顯的改變。相關(guān)研究表明，PI3K/AKT和MEK/ERK這兩條信號通路在促進腫瘤形成的信號中，表現(xiàn)出各自功能的同時也產(chǎn)生了信號通路之間的蛋白相互作用[17-18]。本研究中，由 VER-52296所產(chǎn)生的對PI3K/AKT和MEK/ERK信號通路的抑制，可以對其在細胞凋亡中產(chǎn)生明顯的促進作用以及顯著促使細胞周期靜止等作用做出較為合理的解釋。同時，對這幾條腫瘤形成通路的抑制作用也被認為與克服腫瘤的抗藥性、對治療疾病有益相關(guān)。

綜上，VER-52296顯著抑制惡性PCCs細胞的增殖，這種效果可能是由于使與腫瘤存活和腫瘤形成相關(guān)蛋白下調(diào)或失活所致。 VER-52296是一個非常有潛力的治療惡性PCCs的新型小分子抑制劑。

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