負(fù)載紫杉醇CSNRDARRC-PCL-PGA/TPGS多肽納米顆粒調(diào)控膀胱癌RT112細(xì)胞增生及促凋亡

劉百川 何靈生 張煦 張濤 邱曉拂 李高遠(yuǎn) 陳波特 楊國勝

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，膀胱癌對(duì)紫杉醇等化療藥物敏感，但紫杉醇有難溶于水、半衰期短及毒性大等缺點(diǎn)，因此紫杉醇在臨床上的應(yīng)用受到了限制。目前國內(nèi)外市面銷售的紫杉醇注射液，是將紫杉醇溶解于吐溫中，該制劑臨床用藥不便，安全性低；口服給藥雖可提高患者的順應(yīng)性，但低的水溶解度和胃腸道的外排作用，使紫杉醇的口服生物利用度非常低。因此，開展對(duì)膀胱癌的生物特性的研究，確立防治靶點(diǎn)，尋求新的治療方式對(duì)提高膀胱癌的療效具有一定的重要性。

文獻(xiàn)報(bào)道紫杉醇可通過不同的凋亡機(jī)制發(fā)揮作用，如下調(diào)Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2/M期[1]。有報(bào)道羅勒多糖聯(lián)合紫杉醇可使A549細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度提高，造成線粒體膜電位下降，使細(xì)胞周期停滯在G2/M及S期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加[2]。因此，紫杉醇可以以聯(lián)合治療方式來抑制癌細(xì)胞的生長。噬菌體肽庫展示技術(shù)近幾年來得到迅速發(fā)展，成為生物學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域中有效而重要的工具。目前已知的有膀胱腫瘤導(dǎo)向多肽RGD序列、NVVRQ序列和CSNRDARRC序列(膀胱癌) 等[3-6]。這些多肽在膀胱腫瘤學(xué)的研究中具有重要意義。多肽在今后的臨床診斷和治療中都具有廣闊的前景。已有研究表明，肽段CSNRDARRC與膀胱癌細(xì)胞T24能夠特異性結(jié)合，在膀胱腫瘤細(xì)胞中是重要的配體肽段[4]。

聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)是一個(gè)性能優(yōu)良的乳化劑，TPGS能顯著提高藥物在PLGA納米顆粒中的包封率。TPGS能通過阻斷P-糖蛋白活性而增強(qiáng)藥物的吸收和治療效果，并且有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡、提高抗腫瘤活性，另外藥物與TPGS合用后能明顯增加胃腸道內(nèi)的吸收，提高其生物利用度[7-13]。

隨著納米技術(shù)的開發(fā)研究，尤其是納米藥物制劑的發(fā)展，其在癌癥治療中顯示出巨大的潛力和優(yōu)越性，由于生物可降解聚合物納米顆粒在口服給藥后具有主動(dòng)和被動(dòng)的靶向治療作用，因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用雙靶向多肽CSNRDARRC-PCL-PGA/TPGS載藥納米顆粒來治療膀胱癌，通過CSNRDARRC-PCL-PGA與TPGS形成共混膠束，利用TPGS能抑制P-糖蛋白的外排作用來提高藥物吸收的效率，增加靶器官藥物濃度，為膀胱癌的治療開辟新途徑。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

TPGS[C33O5H54(CH2CH2O)23]及聚己內(nèi)酯(分子量=41 000 Da)和辛酸亞錫[Sn(OOCC7CH15)2][購于西格瑪-奧爾德里奇(圣劉易斯)]；TPGS-b-(PCL-ran-PGA)嵌段共聚物(分子量=25 000 Da)和純度為99.9%的紫杉醇[購于Nano Med生物技術(shù)有限公司(中國深圳)]；配體肽段CSNRDARRC，由半胱氨酸-絲氨酸-天冬酰胺-精氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-半胱氨酸組成的氨基酸序列(上海肽仕生物公司合成)；胎牛血清[購于Gibco(瑞典生物技術(shù)公司)]；甲醇和乙腈[購于EM Science (馬林克羅貝克)]；去離子水(由密理博公司的純水系統(tǒng)制備)；RT112、T24及SV-HUC-1細(xì)胞[購于American Type Culture Collection (Manassas, VA)]。

二、載有紫杉醇的多肽配體-PCL-PGA/TPGS共聚物的納米顆粒的制備

應(yīng)用溶劑萃取/蒸發(fā)法制備納米顆粒[14]。取11 mg 的紫杉醇粉末和100 mg的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)嵌段共聚物，溶解于二氯甲烷中。隨后倒入TPGS(0.03% w/v)溶液中并溫和攪拌。在常溫條件，靜置水油乳濁液過夜。80 000×g離心收集納米顆粒，將收集到的納米顆粒懸浮于去離子水中，凍干。之后TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米顆粒按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法與多肽配體修飾。先將多肽配體配制成0.5 mg/ml的去離子水溶液，然后納米顆粒以9.5 mg/ml的濃度懸浮于多肽配體水溶液中，在冰浴條件下超聲波處理溶液，最后80 000×g離心20 min 收集納米顆粒，即為多肽紫杉醇NP。

三、納米顆粒的表征

1.納米顆粒的大小和表面電動(dòng)勢測定：通過動(dòng)態(tài)光散射測定納米顆粒的平均直徑和顆粒大小分布范圍，所用的儀器是Malvern Zeta sizer Nano-ZS90(馬爾文儀器有限公司)。納米顆粒表面的電荷利用激光多普勒風(fēng)速測量，所用的儀器是Zeta sizer Nano Series instrument (馬爾文儀器有限公司)。所有的測量均進(jìn)行3次驗(yàn)證。

2.納米顆粒的形態(tài)表征：將納米顆粒溶液放置于400目碳包埋的銅網(wǎng)上，隨后通過發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM; Zeiss 77 SUPRA 40VP)檢測其納米顆粒的形態(tài)。

3.藥物裝載和包埋效率測試：采用高效液相色譜(HPLC)法檢測取出的釋放藥物介質(zhì)中紫杉醇的含量。取干燥的5 mg納米顆粒溶解于二氯甲烷中，然后轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相中(乙腈/去離子水，v/v=50∶50)，將上述樣品進(jìn)行HPLC分析。隨后于紫外可見光探測器下監(jiān)測，納米顆粒攝取藥物的能力定義為最終產(chǎn)物中藥物裝載的百分比。所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

4.體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)：取15 mg裝載有藥物的納米顆粒，將其懸浮在5 ml的釋放介質(zhì)中(PBS 7.4 含有 0.1% w/v Tween80)。將納米顆粒懸浮物轉(zhuǎn)移到透析袋，浸潤在釋放介質(zhì)的離心管中。將離心管放置37 °C水浴鍋，并以130 rpm速度旋轉(zhuǎn)。每10 min取出樣品，經(jīng)由HPLC分析。后續(xù)的分析測試方法與測定藥物攝取效率的方法相同。

四、細(xì)胞培養(yǎng)

將RT112、T24及SV-HUC-1細(xì)胞培養(yǎng)于37 °C，5% CO2的組織培養(yǎng)液中。所用的培養(yǎng)液(DMEM)添加了100g/ml鏈霉素和20%胎牛血清，平均每2 d更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長到70%～90%左右，用0.25%的胰蛋白酶-乙烯基聯(lián)氨四乙酸溶液(Invitrogen)消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

五、藥物毒性試驗(yàn)

將RT112、T24及SV-HUC-1細(xì)胞以每孔5 000個(gè)細(xì)胞的密度鋪板在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上過夜。選定紫杉醇作為測試的轉(zhuǎn)載抗腫瘤模式化合物。RT112細(xì)胞在同等濃度(10 mg/L)紫杉醇下分別與多肽紫杉醇-PCL-PGA/TPGS納米顆粒懸浮物(多肽紫杉醇NP)、裝載紫杉醇的TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米顆粒懸浮物(紫杉醇NP)、PCL-PGA/TPGS納米顆粒懸浮物(NP)以及未裝載紫杉醇的多肽TPGS-b-(PCL-ran-PGA)納米顆粒懸浮物(多肽NP)培養(yǎng)液共培育12、24和48 h。在達(dá)到設(shè)定共培育時(shí)間之后，用新鮮的含有MTT(5 mg/ml)DMEM培養(yǎng)液替代含有納米顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后吸走含有MTT的培養(yǎng)液，并加入150 ml DMSO溶解三苯基甲酯形成的晶體，用酶標(biāo)儀(model 680, Bio-Rad Laboratories, United Kingdom)測定每一個(gè)孔在570 nm的吸收。未處理組(Control組)的吸收光強(qiáng)度作為細(xì)胞100%活性的標(biāo)準(zhǔn)，無添加MTT的細(xì)胞孔作為Blank用來計(jì)算熒光分光亮度計(jì)在0的吸收值。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±資料的標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、細(xì)胞周期分析

將RT112細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度鋪板在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上過夜, 隔天加入RT112細(xì)胞,在同等濃度(10 mg/L)紫杉醇下分別與多肽載藥NP、載藥NP以及多肽空NP，于培養(yǎng)液共培育12 h。在達(dá)到24 h后，利用0.25%胰酶消化后分別進(jìn)行PI染劑(0.3% TRIPTON X-100, 25 mg/ml PI, 0.1 mmol/L EDTA 及 10 mg/ml RNase 溶于 PBS))染色30 min，隨后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(Becton Dickinson, BD)。

七、細(xì)胞凋亡分析

1.DAPI細(xì)胞核染色:將細(xì)胞經(jīng)由4%多聚甲醛固定10 min，隨后DAPI染色10 min，在熒光顯微鏡上觀察。

2.Annexin V/PI染色:用胰酶將細(xì)胞消化后分別進(jìn)行Annexin V 及 PI染色 (Dead Cell Apoptosis Kit, Invitrogen, V13241)，隨后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析(Becton Dickinson, BD)。

3.腺粒體膜電位分析:將細(xì)胞經(jīng)過胰酶消化后，利用JC-1染色15 min (Dead Cell Apoptosis Kit, Invitrogen, V13241)，在熒光顯微鏡上觀察。

以上實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞鋪板及納米顆粒處理參考細(xì)胞周期分析方法。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用T檢驗(yàn)法及方差分析來驗(yàn)證變數(shù)平均值的可信性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在P<0.05情況下才被視為有可信性。

結(jié) 果

一、負(fù)載紫杉醇膠束的表征

1.大小及電勢：通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)多肽紫杉醇NP呈窄單分散，平均流體力學(xué)直徑在255.3 nm左右(圖1A)。而透射電鏡的結(jié)果顯示多肽紫杉醇NP是分布均一的球形顆粒，粒徑在240～260 nm (圖1B)。Z電勢測試結(jié)果印證了通過多肽修飾的紫杉醇NP能夠減少納米顆粒表面的負(fù)電荷(表1)。沒有修飾的納米顆粒表面電荷為-20.2 mV，修飾了多肽后，納米顆粒表面電荷為-11.2 mV。負(fù)電荷減少，可以較TPGS-b-(PCL-ran-PGA)更容易進(jìn)入細(xì)胞。

表1 負(fù)載紫杉醇納米顆粒特征

A：粒徑分布；B：透射電鏡圖

圖1 多肽紫杉醇NP粒徑大小及電勢

2.藥物釋放行為：通過HPLC測得多肽紫杉醇NP的載藥量為(8.36±0.05)%(表1)。紫杉醇NP及多肽紫杉醇NP具有相似的紫杉醇釋放模式，開始基本都是爆發(fā)式的釋放(圖2)，之后釋放紫杉醇的速度變緩直到接近于0。紫杉醇NP在40 h釋放了28.87%的紫杉醇，在120 h釋放了41.58%的紫杉醇。多肽紫杉醇NP在40 h釋放了33.87%的紫杉醇，在120 h釋放了45.48%的紫杉醇。

圖2 負(fù)載紫杉醇鈉米顆粒藥物釋放情況

二、多肽紫杉醇顆粒抑制膀胱癌細(xì)胞增殖

在同等濃度(10 mg/L)紫杉醇下RT112及T24分別與多肽紫杉醇NP、紫杉醇NP、多肽顆粒以及空NP于培養(yǎng)液共培育12、24和48 h。紫杉醇NP及多肽紫杉醇NP皆有時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間的增加， RT112及T24細(xì)胞存活率降低，而且多肽紫杉醇NP優(yōu)于紫杉醇NP。而空NP以及多肽NP皆無毒性。細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果(多肽紫杉醇NP組>紫杉醇NP組)與培育時(shí)間相關(guān)。這可能是與納米顆粒持續(xù)和可控的藥物釋放方式有關(guān)系。多肽NP對(duì)SV-HUC-1膀胱上皮細(xì)胞無毒性，多肽紫杉醇NP雖然對(duì)SV-HUC-1膀胱上皮細(xì)細(xì)有些許毒性，但相對(duì)于RT112膀胱癌細(xì)胞而言，多肽紫杉醇NP毒性還是相對(duì)大一點(diǎn)。多肽紫杉醇NP能夠有效抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。

三、多肽紫杉醇NP調(diào)控RT112膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分析

經(jīng)多肽紫杉醇NP、紫杉醇NP以及多肽NP處理后， PI染色顯示，在10 mg/L濃度的紫杉醇下， RT112細(xì)胞經(jīng)由紫杉醇NP處理后，G2/M期增加至28.02%；而多肽紫杉醇NP處理后，G2/M期增加至48.03%，結(jié)果證明多肽紫杉醇NP能使細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G2期，與多肽紫杉醇NP影響細(xì)胞存活率結(jié)果一致。見圖3。

A：空NP；B：紫杉醇NP;C:多肽紫杉醇NP

圖3 負(fù)載紫杉醇納米顆粒對(duì)RT112細(xì)胞周期的影響

四、多肽紫杉醇NP造成膀胱癌細(xì)胞RT112細(xì)胞凋亡

從細(xì)胞存活結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇NP會(huì)造成RT112細(xì)胞的存活率下降，因此我們推測紫杉醇NP可能引發(fā)細(xì)胞凋亡，我們使用Annex V/PI染色來觀察紫杉醇NP對(duì)RT112細(xì)胞的影響。RT112細(xì)胞經(jīng)由紫杉醇NP處理后有些細(xì)胞核濃縮片斷化；而在多肽紫杉醇NP處理后細(xì)胞核濃縮片斷化更明顯，符合細(xì)胞凋亡的表觀現(xiàn)象。見圖4A。Annex V/PI染色顯示，紫杉醇NP處理后細(xì)胞凋亡發(fā)生增加至37.5%，而在多肽紫杉醇NP處理后細(xì)胞凋亡增加至68.0%。見圖4B。證明多肽紫杉醇NP引起的細(xì)胞凋亡較紫杉醇NP更有效，多肽紫杉醇NP較紫杉醇NP更能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

A：DAPI染色；B：Annex V/PI 染色

圖4 負(fù)載紫杉醇納米顆粒對(duì)RT112細(xì)胞凋亡的影響

五、腺粒體膜電位下降引起細(xì)胞凋亡

利用JC-1染色分析紫杉醇NP是否可通過改變腺粒體膜電位而造成細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RT112細(xì)胞經(jīng)紫杉醇NP處理后，紅色熒光減少，綠色熒光增多；而在多肽紫杉醇NP處理后，紅色熒光急速下降，綠色熒光明顯增加，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，有凋亡發(fā)生。見圖5。

圖5 負(fù)載紫杉醇納米顆粒導(dǎo)致線粒體膜電位改變而造成凋亡

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，大多膀胱癌患者使用紫杉醇等化療藥物進(jìn)行治療。但紫杉醇有難溶于水、半衰期短及副作用大等缺點(diǎn)。目前膀胱癌導(dǎo)向多肽在膀胱癌的研究中具有重要意義，如已知的膀胱癌導(dǎo)向多肽RGD序列、NVVRQ序列和CSNRDARRC序列[4-6]，多肽在今后的臨床診斷和治療中都具有廣闊的前景。已有研究表明，肽段CSNRDARRC可與T24膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合，是膀胱腫瘤細(xì)胞研究中重要的配體肽段[4]。 為了改善紫杉醇的缺點(diǎn)，我們利用CSNRDARRC多肽負(fù)載紫杉醇來治療膀胱癌。

多肽-PCL-PGA/TPGS的合成較困難，因PCL是疏水核，不易與多肽連結(jié)。為此我們使用多肽TPGS-b-(PCL-ran-PGA) (多肽NP)和紫杉醇復(fù)合，得到了負(fù)載紫杉醇多肽的膠束TPGS-b-(PCL-ran-PGA) (多肽紫杉醇NP)。從圖1發(fā)現(xiàn)多肽紫杉醇NP呈窄單分散，平均流體力學(xué)直徑在255.3 nm左右，粒徑在240～260 nm。通過ICP-MS，我們測得多肽紫杉醇NP的載藥量約為(8.36±0.05)%(表1)，可能是由于多肽紫杉醇的親水性更好并且分子量較紫杉醇NP小，導(dǎo)致共聚物膨大并且被降解的速度更快，從而加速了紫杉醇從載體中釋放。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，多肽紫杉醇NP組>紫杉醇NP組且與培育時(shí)間呈依賴性，這可能是與納米顆粒持續(xù)和可控的藥物釋放方式有關(guān)系。根據(jù)紫杉醇能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2/M期的報(bào)道，結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為多肽紫杉醇NP可能會(huì)影響細(xì)胞周期，從圖3發(fā)現(xiàn)多肽紫杉醇NP的確能夠使細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G2期，這也與多肽紫杉醇NP影響細(xì)胞存活率結(jié)果一致。經(jīng)由細(xì)胞存活率的結(jié)果可以推測多肽紫杉醇NP可能會(huì)造成細(xì)胞凋亡。

由于早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮，經(jīng)由DAPI染色加深后核染色質(zhì)會(huì)呈現(xiàn)新月形并聚集于核膜一邊，晚期凋亡時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)核碎裂呈大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜所包圍，即凋亡小體，因此利用DAPI染色來觀察細(xì)胞凋亡[15]。從圖4發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由紫杉醇NP處理后有些細(xì)胞核濃縮片斷化；而在多肽紫杉醇NP處理后細(xì)胞核濃縮片斷化更明顯，因此符合細(xì)胞凋亡的表觀現(xiàn)象。利用Annex V/PI染色也驗(yàn)證紫杉醇NP能使細(xì)胞的凋亡情況增加，多肽紫杉醇NP引起的細(xì)胞凋亡較紫杉醇NP更有效。

細(xì)胞凋亡屬于程序性死亡，不同的刺激會(huì)啟動(dòng)不同的信號(hào)通路而促發(fā)凋亡。目前較為經(jīng)典的信號(hào)有兩條:Fas-FasL及caspase啟動(dòng)的信號(hào)通路[16-17]。其中，caspase信號(hào)通路會(huì)破壞腺粒體膜的完整性，使細(xì)胞色素C從腺粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，啟動(dòng)下游的caspase通路，最終引起凋亡發(fā)生[18]。當(dāng)腺粒體膜完整時(shí)，JC-1會(huì)被吸入進(jìn)腺粒體中，形成JC-1聚合物，發(fā)射紅色熒光；但腺粒體膜被破壞后，造成膜電位下降，此時(shí)JC-1會(huì)分散在細(xì)胞質(zhì)中，而發(fā)出綠色熒光，因此可以從JC-1染色來驗(yàn)證細(xì)胞凋亡的通路[19]。從JC-1染色來驗(yàn)證多肽紫杉醇NP對(duì)細(xì)胞凋亡的通路。從圖5結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RT112細(xì)胞經(jīng)多肽紫杉醇NP處理后，紅色熒光急速下降，綠色熒光明顯增加，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，有凋亡發(fā)生的現(xiàn)象。

本研究成功合成了負(fù)載紫杉醇多肽-PCL-PGA/TPGS納米顆粒，通過CSNRDARRC-PCL-PGA與聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS)形成共混膠束，這種表面TPGS包覆的納米載體具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，并且多肽CSNRDARRC具有雙靶向，能夠通過納米載體的方式來抑制RT112細(xì)胞生長，造成RT112膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞周期停滯，并且通過腺粒體膜電位下降而引起細(xì)胞凋亡。綜合以上結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，負(fù)載紫杉醇多肽-PCL-PGA/TPGS納米顆粒載體為膀胱癌的治療提供了一個(gè)新手段，可作為治療膀胱癌的一種潛力藥物。

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