Urocortin在子宮內(nèi)膜異位癥患者組織及血清中的表達(dá)水平及臨床意義

， ，*

(1.湖北省武漢市第八醫(yī)院,430010；2.鄭州人民醫(yī)院婦產(chǎn)科)

子宮內(nèi)膜異位癥(以下簡稱內(nèi)異癥)指具有生長功能的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在子宮腔以外的部位，是一種激素依賴性疾病，以炎癥和血管生成為主要特征，以不孕及疼痛為主要癥狀。內(nèi)異癥雖然是一種良性疾病，但其因具有侵襲、復(fù)發(fā)等惡性行為特征，且有一定的惡變傾向，又被稱為“不死的癌癥”，嚴(yán)重影響育齡女性的身心健康[1]。內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明了，缺乏特異性血清標(biāo)志物，導(dǎo)致其早期診斷和預(yù)后評估存在很大的困難[2]。近年來，有研究表明，內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜中存在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，其所分泌的多種細(xì)胞因子可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中發(fā)揮作用[3]。其中，Urocortin(UCN)是1995年從大鼠中腦中克隆出的一種含 40 個氨基酸的多肽,屬于促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)家族的成員,與CRH有45%的氨基酸同源性,UCN在物種之間有嚴(yán)格的保守性,人源性與鼠源性UCN的氨基酸序列同源性高達(dá)95%。UCN通過與CRH受體1和2(CRH-R1、CRH-R2)結(jié)合發(fā)揮作用,可參與血管生成、炎癥反應(yīng)、凋亡及免疫活動調(diào)節(jié)等[4-5]。因此，猜想UCN可能與內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究鮮有報道。本文分別收集子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜、異位病灶組織和非內(nèi)異癥患者正常子宮內(nèi)膜組織，子宮內(nèi)膜異位癥患者的血清及健康體檢者的血清，分別采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry，IHC)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)對內(nèi)膜組織和血清中的UCN表達(dá)水平進(jìn)行研究，旨在探究其在內(nèi)異癥中的表達(dá)情況并探討其潛在臨床意義，從而為內(nèi)異癥的診斷、治療及預(yù)后評估提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源在本院倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意的情況下，收集本院婦科2012年1月～2016年11月接受手術(shù)患者的子宮內(nèi)膜組織。 實驗組:選取經(jīng)病理證實的內(nèi)異癥患者56例，根據(jù)1997年美國生育學(xué)會提出的“修正子宮內(nèi)膜異位癥分期法”其中I/II期10例，III期/IV 期46例，獲取患者的在位子宮內(nèi)膜及內(nèi)異癥病灶。對照組:因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)，盆腔結(jié)構(gòu)正常、無內(nèi)膜病變的患者50例，獲取患者正常子宮內(nèi)膜。 上述病例均無免疫疾病、急性炎癥及其它雌激素依賴性疾病，術(shù)前3個月內(nèi)未經(jīng)激素替代治療。 實驗組平均年齡為41.40±3.57 歲，對照組平均年齡為44.10±2.42歲，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.063)。實驗組與對照組病例均在術(shù)中收集標(biāo)本，將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛-0.1 mol/L磷酸緩沖液中。另外，于術(shù)前留取上述56例內(nèi)異癥患者血樣用于后續(xù)研究。留取體檢中心健康患者的血清樣本56例作為對照組。

1.2主要試劑及儀器兔抗人UCN多克隆抗體購自美國Abcam公司；羊抗兔/小鼠酶標(biāo)二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；人UCN ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；石蠟組織包埋機(jī)購自美國Leica公司；石蠟切片機(jī)購自美國Leica公司；電磁爐購自中國九陽公司；電熱恒溫干燥箱購自上海捷成實驗儀器有限公司；光學(xué)生物顯微鏡及成像系統(tǒng)購自日本尼康公司。

1.3實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法(SP) 子宮內(nèi)膜及內(nèi)異癥病灶組織于20倍體積的4%多聚甲醛-0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)中室溫固定至少24 h，后續(xù)進(jìn)行常規(guī)脫水及石蠟包埋處理，4 μm連續(xù)切片，用免疫組織化學(xué)SP法檢測UCN蛋白的表達(dá)水平。具體操作步驟簡述如下：二甲苯脫蠟3次，每次10 min，0.3%過氧化氫-甲醇溶液室溫避光封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，梯度乙醇水化，蒸餾水及PBS沖洗5 min，各3次，采用pH 6.0檸檬酸緩沖液高溫高壓修復(fù)法修復(fù)抗原2.5 min，自來水沖洗冷卻20 min后PBS沖洗3次；山羊血清室溫封閉20 min，滴加1∶100倍稀釋的兔抗人UCN一抗，陰性對照組用一抗稀釋液替代，室溫下孵育1～2 h(視溫度而定)，PBS沖洗3次；滴加羊抗兔/小鼠酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h后，PBS沖洗3次，應(yīng)用DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢并采集圖像。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA) 收集內(nèi)異癥患者術(shù)前及體檢者清晨空腹外周靜脈血2 mL至真空促凝采血管中，3 000 rpm離心15 min，取上層血清分裝并保存于-80 ℃冰箱中備用。血清UCN水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)，操作嚴(yán)格按照試劑公司提供的說明書進(jìn)行。實驗步驟簡述如下：①標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋及加樣；②血清樣品稀釋5倍后加樣；③37 ℃孵育30 min；④洗滌5次，拍干；⑤加入酶標(biāo)試劑，每孔50 μL，37 ℃孵育30 min；⑥同④；⑦顯色：每孔加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕混勻，37 ℃避光顯色15 min；⑧終止：每孔加入終止液50 μL；⑨酶標(biāo)儀檢測OD450。

1.3.3 結(jié)果判斷 綜合切片中陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞百分比和陽性細(xì)胞著色強度兩項指標(biāo)半定量進(jìn)行判定。根據(jù)顯色程度判斷陽性強度，無著色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占觀察細(xì)胞的百分比分為:陽性細(xì)胞數(shù)10%為1分,10%～50%為2分,50%為3分,將兩者分?jǐn)?shù)相乘,0分計為陰性(-),1～3分計為弱陽性(+),4～6分計為陽性(++),7～9分計為強陽性(+++)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行分析，分類資料樣本率比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 UCN在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及其與內(nèi)異癥臨床因素之間的關(guān)系UCN在實驗組和對照組子宮內(nèi)膜及異位病灶組織中均有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色至棕褐色。內(nèi)異癥在位內(nèi)膜及異位病灶分別與正常子宮內(nèi)膜相比，UCN的表達(dá)顯著增強(P<0.001)。而UCN在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和異位病灶中的表達(dá)無明顯差異(P=0.374)。詳見圖1、表1。將UCN表達(dá)水平與內(nèi)異癥臨床因素之間的關(guān)系進(jìn)行分析，統(tǒng)計結(jié)果表明UCN的表達(dá)水平在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和異位病灶中，隨著內(nèi)異癥分期的進(jìn)展逐漸升高(P<0.001)。同時，UCN在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜和異位病灶中的表達(dá)水平隨卵巢子宮內(nèi)膜異位癥囊腫直徑的增加而升高(P<0.001)。然而，內(nèi)異癥中UCN的陽性程度與患者BMI指數(shù)、是否痛經(jīng)、所處月經(jīng)周期等情況無關(guān)(P>0.05)。詳見表2、表3。

圖1 UCN在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)A1、在位內(nèi)膜(100×)； B1、異位病灶(100×)；C1、正常內(nèi)膜(100×)；A2、在位內(nèi)膜(400×)；B2、異位病灶(400×)； C2、正常內(nèi)膜(400×)

表1 子宮內(nèi)膜異位癥中UCN的表達(dá)水平(例，%)

表2內(nèi)異癥在位內(nèi)膜中UCN的表達(dá)水平與臨床因素之間的關(guān)系(例，%)

臨床因素n++++++χ2P分期I/II期104(40.0)6(60.0)0(0.0)III-IV期4642(91.3)4(8.7)0(0.0)14.740<0.001病灶直徑<3.0 cm126(50.0)6(50.0)0(0.0)>3.0 cm4440(90.9)4(9.1)0(0.0)10.757<0.001BMI指數(shù)<18.521(50.0)1(50.0) 0(0.0)18.5～24.94236(85.7)6(14.3)0(0.0)25.0～28.086(75.0)2(25.0)0(0.0)>28.043(75.0)1(25.0)0(0.0)2.191>0.05痛經(jīng)有3125(80.6)6(19.4)0(0.0)無2521(84.0)4(16.0) 0(0.0)0.106>0.05月經(jīng)周期增殖期3629(80.6)7(19.4)0(0.0)分泌期2017(85.0)3(15.0)0(0.0)0.173>0.05

表3 內(nèi)異癥異位病灶中UCN的表達(dá)水平與臨床因素之間的關(guān)系(例，%)

2.2 UCN在內(nèi)異癥患者血清中的表達(dá)

內(nèi)異癥患者血清UCN水平(54.40±9.12 pg/mL)顯著高于正常對照組(21.30±4.72 pg/mL)(t=10.196，P<0.001)。

3 討 論

內(nèi)異癥是育齡期女性的常見病，目前診治難點在于早期診斷困難且易復(fù)發(fā)。內(nèi)異癥是一種多病因疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚無定論。目前，最為廣泛接受的是Sampson[6]提出的經(jīng)血逆流學(xué)說，即脫落的子宮內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流進(jìn)入盆腔，粘附和侵襲入腹膜間皮層，進(jìn)而形成新生血管，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜組織的異位形成。但經(jīng)血逆流的發(fā)生率高達(dá)70%～90%，僅有約10%～15%的女性患有子宮內(nèi)膜異位癥[7]，究其原因，有國內(nèi)學(xué)者提出了“在位內(nèi)膜決定論”[8-9]，與正常子宮內(nèi)膜相比，內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜在血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移以及凋亡等方面存在諸多基因差異和蛋白表達(dá)異常。近年來，有研究表明，內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜中存在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，其所分泌的多種細(xì)胞因子可能在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3]。其中，UCN可參與血管生成、炎癥反應(yīng)、凋亡及免疫活動調(diào)節(jié)等[10]。因此，本文通過將56例內(nèi)異癥在位內(nèi)膜、異位病灶及內(nèi)異癥患者血清中UCN的表達(dá)情況與正常對照組進(jìn)行對比，結(jié)果表明內(nèi)異癥在位內(nèi)膜及異位病灶組織中，UCN的表達(dá)顯著增高。進(jìn)而將其表達(dá)水平與多種臨床因素相分析表明，UCN的表達(dá)與內(nèi)異癥的分期和病灶大小高度相關(guān)，隨著疾病的進(jìn)展，UCN的表達(dá)逐漸增強。

目前，內(nèi)異癥的無創(chuàng)性診斷多依賴于臨床表現(xiàn)及影像學(xué)，這使得一部分無癥狀或早期內(nèi)異癥受到了忽視，進(jìn)而影響了相關(guān)的治療。CA125是目前廣泛應(yīng)用于臨床的一種卵巢腫瘤的血清學(xué)標(biāo)志物，但是其特異性不夠高，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、腹膜炎及盆腔炎中均有升高的可能[11-15]?？梢姡錍A125并不是一種十分可靠的內(nèi)異癥分子標(biāo)志物。因此，尋找一種更佳有效的內(nèi)異癥特異性血清標(biāo)志物顯得尤為重要[16-17]。UCN作為一種分泌性的細(xì)胞因子，可在血清中檢出，與血管生成、炎癥反應(yīng)、凋亡及免疫活動調(diào)節(jié)等生理及病理過程相關(guān)。因而血清UCN可能成為一種潛在的內(nèi)異癥血清標(biāo)志物。本研究檢測了56例內(nèi)異癥患者和56例正常體檢者的血清UCN水平。結(jié)果表明，內(nèi)異癥患者的血UCN水平為(54.40±9.12 pg/mL)，顯著高于正常對照組(21.30±4.72 pg/mL)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.196，P<0.001)。因此，血清UCN有可能成為一種極具潛力的內(nèi)異癥標(biāo)志物。

綜上所述， UCN的異常表達(dá)與內(nèi)異癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，UCN可能成為內(nèi)異癥治療的新靶點。另外，對UCN的深入研究有助于進(jìn)一步了解內(nèi)異癥的生物學(xué)特性，同時為內(nèi)異癥的早期診斷、預(yù)后估計及療效評估提供一個新的分子標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

[1] GIUDICE LC.Clinical practice endometriosis[J].N Engl J Med,2010,362(25):2389-98.

[2] HUMMELSHOJ L.Endometriosis:an old problem without a current solution [J].Acta Obstet Gynecol Scand,2017,96(6):779-82.

[3] WANG G,TOKUSHIGE N,RUSSELL P,et al.Neuroendocrine cells in eutopic endometrium of women with endometriosis [J].Hum Reprod,2010,25(2):387-91.

[4] JOAN VAUGHAN,CYNTHIA DONALDSON,JACKSON BITTENCOURT,et al.Urocortin,a mammalian neuropeptide related to fish urotensin I and to corticotropin-releasing factor[J].Nature,1995,378(6554):287-92.

[5] FLORIO P,REIS F M,TORRES P B,et al.Plasma urocortin levels in the diagnosis of ovarian endometriosis[J].Obstet Gynecol,2007,110(3):594-600.

[6] SAMPSON J A.Metastatic or embolic endometriosis,due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the venous circulation [J].Am J Pathol,1927,3(2):93-110.

[7] The epidemiology of endometriosis.The epidemiology of endometriosis[J].Ann N Y Acad Sci,2002,30(1):1-19.

[8] 郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的在位內(nèi)膜決定論[C].第八次全國婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編,2004(11-1):81-2.

[9] 郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥研究的新里程[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2005,40(1):3-4.

[10] NOVEMBRI R,CARRARELLI P,TOTI P,et al.Urocortin 2 and urocortin 3 in endometriosis:evidence for a possible role in inflammatory response [J].Mol Hum Reprod,2011,17(9):587-93.

[11] SONG MJ,LEE SH,CHOI MR,et al.Diagnostic value of CA125 as a predictor of recurrence in advanced ovarian cancer [J].Eur J Gynaecol Oncol,2013,34(2):148-51.

[12] HIRSCH M,DUFFY JM,DEGUARA CS,et al.Diagnostic accuracy of cancer antigen 125 (CA125) for endometriosis in symptomatic women:a multi-center study [J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2017,210 (5):102-7.

[13] KIL K,CHUNG JE,PAK HJ,et al.Usefulness of CA125 in the differential diagnosis of uterine adenomyosis and myoma [J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2015,185(16):131-5.

[14] PANORCHAN K,DAVENPORT A.Diagnostic and prognostic role of peritoneal CA125 in peritoneal dialysis patients presenting with acute peritonitis [J].BMC Nephrol,2014,12(15):149.

[15] MOORE RG,MILLER MC,STEINHOFF MM,et al.Serum HE4 levels are less frequently elevated than CA125 in women with benign gynecologic disorders [J].Am J Obstet Gynecol,2012,206(4) 351-8.

[16] KOCBEK V,VOUK K,BERSINGER NA,et al.Panels of cytokines and other secretory proteins as potential biomarkers of ovarian endometriosis [J].J Mol Diagn,2015,17(3):325-34.

[17] KOCBEK V,VOUK K,MUELLER MD,et al.Elevated glycodelin-A concentrations in serum and peritoneal fluid of women with ovarian endometriosis[J].Gynecol Endocrinol,2013,29(5):455-9.