腦卒中l(wèi)ncRNA與mRNA表達(dá)譜分析

王璽，王凡，寧浩宇，白雪峰

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)醫(yī)學(xué)信息學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

0 引言

腦卒中（Stroke）又稱“中風(fēng)”、“腦血管意外”（cerebralvascular accident，CVA）。是一種急性腦血管疾病，腦卒中是發(fā)達(dá)國家嚴(yán)重的長期神經(jīng)功能障礙的主要原因，發(fā)病率約為0.25-4%，死亡率約為30%[1]。大量的證據(jù)表明，缺血性腦卒中伴隨著一系列的神經(jīng)事件，如缺氧、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[2]，最終導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞急性壞死、細(xì)胞凋亡和自我死亡[3]。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA和mRNA的表達(dá)異常在腦卒中中起到了重要的作用，因此，我們通過研究來確定引起腦卒中新的發(fā)病機(jī)制,探索有效的預(yù)防和治療腦卒中手段。本文就通過表達(dá)譜分析，對(duì)lncRNA和mRNA的交互作用與腦卒中關(guān)系進(jìn)行研究，初步探討了腦卒中發(fā)病機(jī)制中l(wèi)ncRNA和mRNA的作用，對(duì)lncRNA的功能進(jìn)行注釋分析。

（1） mRNA與腦卒中

隨著近年來研究發(fā)現(xiàn)，mRNA在腦卒中疾病發(fā)生起著關(guān)鍵的角色。最新研究發(fā)現(xiàn)分化群（CD46）是心源性腦卒中的潛在生物標(biāo)志物。并以CD46 mRNA為目標(biāo)，這一結(jié)果通過熒光酶的報(bào)告分析進(jìn)一步證實(shí)[4]。隨著更多的研究發(fā)現(xiàn)大量的mRNA與腦卒中的發(fā)生有著十分密切的聯(lián)系，如：Toll-Like受體3和干擾素βmRNA表達(dá)在缺血性卒中患者的外周血中增加，且預(yù)后良好[5]。通過以上的證明mRNA在腦卒中的各個(gè)階段都扮演著重要的角色。

（2）LncRNA與腦卒中

LncRNA(long noncoding RNA，lncRNA)指 的 是長度超過200nt。目前研究，超過一半的lncRNAs在大腦中表達(dá)[6]，它們調(diào)節(jié)了許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。研究證實(shí)，lncRNA H19通過驅(qū)動(dòng)組蛋白脫乙酰酶，促進(jìn)缺血性中風(fēng)的神經(jīng)炎癥。這表明找到一種基于H19的診斷和治療缺血性中風(fēng)的可能方法[8]。目前，研究表明，通過調(diào)節(jié)特定的lncRNA，可以改變后缺血性神經(jīng)元的死亡和/或再生/再生。這些研究對(duì)治療疾病很有意義,通過調(diào)節(jié)這些目標(biāo)，能夠進(jìn)一步防止中風(fēng)后腦損傷[9]。隨著科研的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)越來越多的lncRNA與腦卒中的并發(fā)有著千絲萬縷的關(guān)聯(lián)，MEG3通過激活p53介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元死亡腦卒中,MEG3作為缺血細(xì)胞死亡啟動(dòng)子在生理和功能上與p53進(jìn)行交互調(diào)解缺血性損傷[10]。對(duì)于以上的研究，我們不難發(fā)現(xiàn)lncRNA在腦卒中中有著非常重要的功能及作用，對(duì)lncRNA調(diào)節(jié)腦缺血性損傷的分子機(jī)制的研究提供潛在的新治療靶點(diǎn)。

1 腦卒中表達(dá)譜分析

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

從 NCBI上下載mRNA數(shù)據(jù)(GSE16561)和，并利用GPL570平臺(tái)blast重注釋得到lncRNA，數(shù)據(jù)包括39個(gè)病人樣本和24個(gè)正常樣本，差異基因的選取通過SAM算法獲得，通過R代碼進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，選取差異表達(dá)的lncRNA和mRNA(p-value＜0.05)，得到1038個(gè)lncRNAs和6085mRNAs，采取皮爾森系數(shù)方法(cor＞0.8),構(gòu)建lncRNAs-mRNAs互作網(wǎng)，并從HMDD數(shù)據(jù)庫下載Protein-Protein互作對(duì)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化，最終形成lncRNAs-mRNAs互作網(wǎng)絡(luò)。用Cytoscape插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功能模塊挖掘，獲得5個(gè)功能顯著性模塊，最后通過David進(jìn)行基因的功能注釋，數(shù)據(jù)分析見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)分析流程圖

1.2 表達(dá)譜網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)于形成lncRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，結(jié)點(diǎn)數(shù)2223個(gè)，4431條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，度越大的基因連接的邊越多，另外，還有一些結(jié)點(diǎn)雖然度小，但在結(jié)點(diǎn)間傳輸起到重要作用的橋梁作用，這些結(jié)點(diǎn)的關(guān)系，可能作為腦卒中的潛在的致病基因。結(jié)果見圖2。

1.3 網(wǎng)絡(luò)模塊挖掘

利用Cytoscape中的JActivemodule插件進(jìn)行模塊挖掘。獲得5個(gè)功能性顯著模塊（module1-module5），結(jié)果見圖3。

1.4 Gene ontology(GO)分析

通過David在線平臺(tái)完成對(duì)模塊中重要結(jié)點(diǎn)進(jìn)行功能分析，篩選出具有診斷意義的顯示lncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)。通過以上步驟進(jìn)一步對(duì)腦卒中l(wèi)ncRNAs的功能進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

圖2 網(wǎng)絡(luò)度分布

2.1 差異表達(dá)lncRNAs、mRNAs

對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到差異表達(dá)的 mRNAs、miRNAs， 取 表 達(dá) 譜 差 異 的 mRNAs、lncRNAs前5%做熱圖，結(jié)果見圖4。

在mRNAs表達(dá)譜的熱圖中，module1中顯著表達(dá)的有 VIPR1，MEOX2；module2中含有 DDHD2；在lnc表達(dá)譜的熱圖中，顯著表達(dá)的有LINC00314。LINC00315腦卒中的發(fā)生都起到重大作用。

2.2 lncRNAs-mRNAs網(wǎng)絡(luò)模塊

通過模塊挖掘來研究lncRNAs、mRNAs在癌癥當(dāng)中的共調(diào)控方式、以及基于局部策略來分析mRNAs的在腦卒中中的功能，見表1。

圖3 lncRNAs-mRNAs模塊圖

圖4 lncRNAs和mRNAs表達(dá)譜熱圖

表1 各模塊中邊、點(diǎn)數(shù)量和所含lncRNAs,mRNAs數(shù)量

在五個(gè)模塊中，PLAG1別名(PSA)同時(shí)存在于模塊一和模塊二中，可見它是一個(gè)十分重要的因子，已有研究證實(shí)PLAG1來自人類胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)組織的完整性和腦卒中的行為表現(xiàn)。[11]在模塊二中，SNHG12作為lncRNA,重復(fù)出現(xiàn)在模塊五中。另外，一些研究通過RNA排序(RNA-seq)技術(shù)，體外模擬缺血性卒中條件，由此證明了SNHG12在大腦血管系統(tǒng)中起著重要的調(diào)控作用。模塊三和模塊四中，VIP是一種血管活性增強(qiáng)肽，廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和各種脊椎動(dòng)物的外圍器官，可以保護(hù)受感染腦細(xì)胞不受損害，其機(jī)制是內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)的表達(dá)，證實(shí)了這些肽的極強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)潛力，表明他可能為中風(fēng)治療中提供新的靶點(diǎn)。在模塊五中，SNHG12，LINC01215，TMEM161B-AS1都是十分重要的lncRNA,它們相互連接多種基因，形成靶向關(guān)系，TERF2IP 通過調(diào)控血小板蛋白表達(dá)來間接影響腦卒中的發(fā)生[12]。

2.3 模塊功能分析

對(duì)五個(gè)模塊分別進(jìn)行GO功能注釋，結(jié)果見圖5，我們可以看出有很多相同功能同時(shí)出現(xiàn)在多個(gè)模塊中，例如：regulation of nucleobase-containing compound metabolic process，表示腦卒中疾病與代謝密切相關(guān)。 organic cyclic compound biosynthetic process注釋到四個(gè)模塊中，這一功能與有機(jī)環(huán)狀化合物生物合成有關(guān),可能與血管炎癥相關(guān),血管炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的重要發(fā)病機(jī)制,研究表明促炎基因在缺血性腦卒中起到重要作用。

圖5 模塊功能注釋

3 結(jié)語

為了明確腦卒中l(wèi)ncRNAs與mRNAs如何行使調(diào)控作用，通過對(duì)腦卒中芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到lncRNA-mRNAs網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊挖掘獲得5個(gè)顯著性模塊，對(duì)模塊進(jìn)行分析，最后，通過本文的研究，發(fā)現(xiàn)lncRNAs與mRNAs協(xié)同作用的一些結(jié)果，為今后更深入的研究腦卒中提供指導(dǎo)和借鑒。眾多研究已表明，lncRNA及mRNA通過多種途徑參與腦卒中的發(fā)生及發(fā)展過程，并提供新的治療靶點(diǎn)，對(duì)腦卒中的發(fā)生，治療，預(yù)后都有必要的作用。例如，我們發(fā)現(xiàn)SNHG12這個(gè)重要的lncRNA,通過去除腦內(nèi)皮組織抑制缺血性中風(fēng)腦血管功能障礙，可與多個(gè)mRNA相互作用，對(duì)腦卒中產(chǎn)生影響，VIP這種血管肽也為腦卒中的治療提供線索，與藥物靶點(diǎn)，而且通過功能注釋，生物體代謝存在密切的關(guān)系。由此看來，lncRNA與mRNA的相互作用對(duì)疾病發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生了不可忽視的影響,我們要對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探索，為診斷和治療腦卒中等提供新的方向。

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