基于gL蛋白的牛傳染性鼻氣管炎間接ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

張 鹿，付 祥，柳翠翠，陳鈺彬，郭珂宇，趙桂新，張志強(qiáng)，史秋梅，吳同壘

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004)

牛傳染性鼻氣管炎病(infections bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的一種接觸性傳染病，臨床上以嚴(yán)重的呼吸道感染、結(jié)膜炎、流產(chǎn)、外陰陰道炎、龜頭炎等為主要癥狀[1]。感染牛常呈現(xiàn)隱性感染，進(jìn)而不斷傳染其他健康牛，在牛群免疫力低下或發(fā)生應(yīng)激時(shí)，可發(fā)展為急性感染，造成大量經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為B類疫病，也是我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物必檢疾病之一[4-5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)關(guān)于牛發(fā)生IBR的報(bào)道迅速增加，分析其原因主要包括幾個(gè)方面：一是牛繁育基地往往不是牛肉或牛奶產(chǎn)地，不同地區(qū)間牛運(yùn)輸頻繁；二是從國(guó)外輸入精液、胚胎、種牛等動(dòng)物或動(dòng)物產(chǎn)品時(shí)，存在漏檢的情況；三是集約化養(yǎng)殖導(dǎo)致IBR的傳播速度加快，陽(yáng)性率增高[6-7]。

有效控制IBRV發(fā)生擴(kuò)散的關(guān)鍵所在是建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。針對(duì)IBR的檢測(cè)往往采用iELISA方法，試劑盒多為進(jìn)口，成本較高，國(guó)產(chǎn)試劑盒較少，供應(yīng)量嚴(yán)重不足，且存在漏檢等問(wèn)題。IBRV屬皰疹病毒科,α皰疹病毒亞科，有囊膜，相對(duì)分子質(zhì)量大，編碼70余種蛋白，其中g(shù)L蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為17 kDa，主要功能為介導(dǎo)病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵入和病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體[8]。本試驗(yàn)在對(duì)gL蛋白原核表達(dá)的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)IBR血清抗體的iELISA方法，為IBR的檢疫防控提供了重要的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒IBRV的分離株為河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存；牛腎細(xì)胞(MDBK)和質(zhì)粒pET-32a均保存于河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試驗(yàn)試劑限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶，購(gòu)自賽默飛公司；IPTG誘導(dǎo)劑、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、鼠源抗His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記兔抗牛IgG抗體，購(gòu)自北京康為世紀(jì)；牛血清白蛋白購(gòu)自Biosharp；馬血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；IBRV陰、陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；IBR抗體檢測(cè)試劑盒(gB)購(gòu)自美國(guó)IDEXX。

1.3 臨床樣品171份臨床牛血清樣品由本試驗(yàn)室保存，采自石家莊、唐山、承德、廊坊。IBR、牛病毒性腹瀉(BVD)、牛布魯菌病和牛O型口蹄疫(FMD)的陽(yáng)性牛血清均由本試驗(yàn)室提供。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank已登錄的IBRV全基因組序列(NC_001847)，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)IBRVgL基因相應(yīng)的引物，引物序列如下,gL-F：5′-GAGGATCCCTGGCGGCGCTGCTGTGGCTCC-3′(BamHⅠ酶切位點(diǎn))，gL-R：5′-ATGAATTCCTAGCGGTAGATGCCG-TCGCC-3′(EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。引物合成服務(wù)由上海生工生物有限公司提供。

1.5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)純化以提取的IBRV DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增gL基因?；厥詹⒓兓肂amHⅠ、EcoRⅠ對(duì)gL基因雙酶切，克隆至pET-32a表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-gL，經(jīng)菌落PCR鑒定后由生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序鑒定。將pET32a-gL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)中，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h，離心后超聲破碎，收集上清沉淀和全菌樣品進(jìn)行可溶性分析，然后用Ni-NTA親和層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，并用SDS-PAGE電泳分析純化效果。誘導(dǎo)表達(dá)后的gL蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)膜后，用稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為一抗，稀釋的兔抗牛IgG(HRP)為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.6 間接ELISA方法的優(yōu)化及建立采用方陣法確定抗原最佳包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度。優(yōu)化以下條件：包被抗原最佳質(zhì)量濃度(197.945,98.970,49.486,24.743,12.372,6.185,3.093,1.546,0.773 mg/L)；抗原包被條件(4℃過(guò)夜、37℃ 1 h+4℃過(guò)夜、37℃ 2 h+4℃過(guò)夜、37℃ 3 h+4℃過(guò)夜；室溫1 h+4℃過(guò)夜、室溫2 h+4℃過(guò)夜、室溫3 h+4℃過(guò)夜)、血清最佳稀釋度(1∶20,1∶40,1∶80,1∶160,1∶320,1∶640)；封閉條件(5%脫脂牛奶、10%脫脂牛奶、1%BSA、3%BSA、10%馬血清、10%明膠)；封閉條件(37℃ 1 h、37℃ 2 h、37℃ 3 h、室溫1 h、室溫2 h、室溫3 h)；血清孵育時(shí)間(37℃ 30 min、37℃ 60 min、37℃ 90 min、室溫30 min、室溫60 min、室溫90 min)；兔抗牛IgG-HRP稀釋度(1∶3 000,1∶5 000,1∶7 000,1∶10 000,1∶50 000,1∶20 000)；孵育條件(37℃ 15 min、37℃ 30 min、37℃ 60 min、室溫15 min、室溫30 min、室溫60 min)；TMB顯色時(shí)間(37℃ 5,10,15 min；室溫5,10,15 min)。測(cè)定樣品D450 nm值。最佳條件判定標(biāo)準(zhǔn)為P/N值最高，陽(yáng)性血清D450 nm≥1，陰性血清D450 nm較小的值，所對(duì)應(yīng)的條件作為ELISA最佳條件。

1.8 間接ELISA特異性試驗(yàn)用已建立的間接ELISA方法對(duì)IBRV、BDV、牛布魯菌病和FMD陽(yáng)性牛血清進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的特異性。

1.9 間接ELISA敏感性試驗(yàn)將IBRV陽(yáng)性血清按2倍倍比稀釋1∶20～1∶3 000，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè)，確定該方法的敏感性。

1.10 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)2種不同批次的酶標(biāo)板進(jìn)行包被，隨機(jī)選取4份陰陽(yáng)性血清樣品稀釋后用篩選出的優(yōu)化條件對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，每組設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，測(cè)定D450 nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該間接ELISA方法的批內(nèi)、批間重復(fù)性。

1.11 間接ELISA臨床樣品檢測(cè)用本研究建立的IBRV間接ELISA方法和IDEXX公司的gB-ELISA試劑盒對(duì)本試驗(yàn)室保存的171份血清進(jìn)行檢測(cè)，并分析IBRV抗體總陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 gL重組蛋白表達(dá)及純化經(jīng)PCR鑒定驗(yàn)證后，陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切后獲得628 bp的目的片段，與預(yù)期大小一致，測(cè)序結(jié)果顯示無(wú)突變和移碼，表明pET-32a-gL表達(dá)載體正確構(gòu)建。SDS-PAGE結(jié)果顯示得到 37 kDa 的蛋白條帶，與預(yù)期大小相符(圖1A)。Western blot鑒定結(jié)果顯示，在約 37 kDa處出現(xiàn)了特異性目的條帶，與預(yù)期相符(圖1B)，表明成功獲得了gL蛋白且該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M.蛋白質(zhì)預(yù)染Marker；A1.空載；A2.沉淀；A3.上清；A4.全菌；B1.空載；2.gL蛋白

2.2 間接ELISIA方法的建立及反應(yīng)條件的確定以重組gL蛋白作為包被抗原建立iELISA檢測(cè)方法，經(jīng)優(yōu)化試驗(yàn)后各反應(yīng)條件見表1。

表1 iELISA反應(yīng)條件

圖2 陰性樣品檢測(cè)正態(tài)分布圖

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果選擇優(yōu)化后的gL-iELISA方法對(duì)FMD、BVD、布魯菌病、IBR陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示IBRV陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其余檢測(cè)結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，該方法具有較強(qiáng)的特異性，僅對(duì)IBRV陽(yáng)性血清有良好的反應(yīng)，而對(duì)其他血清無(wú)反應(yīng)。

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果選擇優(yōu)化后的gL-iELISA方法檢測(cè)經(jīng)1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1 280，1∶2 560等梯度稀釋IBRV陽(yáng)性血清，結(jié)果顯示，陽(yáng)性血清經(jīng)最高稀釋度為1∶640稀釋后檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性，表明該方法具有較高的敏感性(圖3)。

圖3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果用2種不同批次的酶標(biāo)板包被抗原檢測(cè)4份陰性血清樣品和4份陽(yáng)性血清樣品，計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果顯示陰性血清樣品批內(nèi)變異系數(shù)為1.9%～6.2%，批間變異系數(shù)為2.6%～4.0%；陽(yáng)性血清樣品批內(nèi)變異系數(shù)為2.9%～7.7%，批間變異系數(shù)為2.7%～4.6%(表2)。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性較好。

表2 重組蛋白gL重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 臨床樣品的檢測(cè)用所建立的gL-iELISA對(duì)采自河北省內(nèi)的171份血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出陽(yáng)性血清67份，抗體總陽(yáng)性率為39%(67/171)，IDEXX公司的gB-ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率為35%，二者的陽(yáng)性符合率為89.6%，陰性符合率為93.6%(表3)。結(jié)果表明，該方法具有較高的準(zhǔn)確性。

表3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

自1980年以來(lái)我國(guó)不斷有牛群感染IBR的報(bào)道，陽(yáng)性率迅速攀升[9-11]。病毒侵入牛體后,以潛伏感染和持續(xù)性感染為特征,病牛長(zhǎng)期乃至終生帶毒,給控制和消滅本病帶來(lái)極大困難,一旦牛群發(fā)生此病將很難根除[12]。當(dāng)牛群受應(yīng)激時(shí)可造成大規(guī)模感染，可嚴(yán)重影響牛群健康，導(dǎo)致肺炎、流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降，同時(shí)可造成免疫抑制，從而繼發(fā)感染，進(jìn)一步加重病情，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。根據(jù)目前的防控措施，在不接種疫苗的情況下，抗體陽(yáng)性牛即可被認(rèn)定為傳染源，需進(jìn)行嚴(yán)格檢疫。因此，血清學(xué)檢測(cè)方法是進(jìn)行IBR防控的關(guān)鍵技術(shù)手段[13]。本試驗(yàn)選擇對(duì)gL蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，建立了檢測(cè)IBR血清的iELISA方法，并進(jìn)行了臨床樣品的檢測(cè)，為IBR的防控提供了重要技術(shù)支撐。

IBRV可感染牛的多個(gè)臟器，但由于多數(shù)牛呈隱性感染，間歇性排毒，導(dǎo)致病原檢出率較低，不適用于普篩。而該病毒一旦侵入機(jī)體，可不斷刺激免疫系統(tǒng)，引起抗體的持續(xù)分泌，因此，血清學(xué)檢測(cè)能夠較為客觀地反映牛群的感染情況[14]。目前，IBRV特異性抗體的檢測(cè)方法有多種，國(guó)外已經(jīng)有利用體外表達(dá)gB蛋白作為診斷抗原建立的ELISA診斷試劑盒(如荷蘭賽迪、美國(guó)愛德士、西班牙海博萊等)，但價(jià)格昂貴且購(gòu)買周期長(zhǎng)；國(guó)內(nèi)近幾年有幾家公司生產(chǎn)基于gB抗原的iELISA試劑盒，但一般僅能用于科研需要，其敏感性、特異性不足，尚無(wú)法滿足臨床檢測(cè)的需要[15]，有鑒于此，本試驗(yàn)選擇gL蛋白建立iELISA方法，期望能夠用于大規(guī)模臨床樣品的檢測(cè)，同時(shí)大大降低檢測(cè)成本。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以gL蛋白為包被抗原建立的IBRV間接ELISA抗體檢測(cè)方法，與FMD、BVD、布魯菌病陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，且該方法具有良好的重復(fù)性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證該iELISA方法的實(shí)用性，本試驗(yàn)選擇171份牛血清，同時(shí)利用該iELISA方法和進(jìn)口試劑盒(愛德士)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示本方法陽(yáng)性率為39%(67/171)，IDEXX試劑盒的陽(yáng)性率為35%，二者的陽(yáng)性符合率為89.6%，陰性符合率為93.6%，表明本試驗(yàn)建立的IBR抗體檢測(cè)iELISA方法具有良好的臨床應(yīng)用前景。

綜上，本試驗(yàn)建立了一種基于gL蛋白的檢測(cè)IBR抗體的iELISA方法，具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性等，可以用于大規(guī)模臨床樣品檢測(cè)。