姜黃素對(duì)放射性腦損傷大鼠行為學(xué)與血腦屏障保護(hù)作用的研究

胡乃霞 石巖 徐誠 張謙 尚紅記 王安營 李蘭華 劉運(yùn)林

1泰安市中心醫(yī)院（山東泰安271000）；2泰安市第一人民醫(yī)院（山東泰安271000）；3泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（山東泰安271000）

放射性腦損傷（radiation injured brain，RIB）是腦組織受到射線輻射后產(chǎn)生的直接或繼發(fā)性損傷，多見于鼻咽癌放療后［1］，目前仍缺乏有效的治療手段。本課題組以往的研究顯示：射線可對(duì)RIB大鼠造成行為學(xué)及腦組織改變，射線也能誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、壞死。姜黃素對(duì)放射性內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，為探討姜黃素對(duì)射線損傷的腦組織是否具有保護(hù)作用，故進(jìn)行了本次實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用姜黃素治療RIB大鼠，觀察各組大鼠行為學(xué)及組織病理學(xué)改變，有望闡明姜黃素對(duì)RIB大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料成年健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（180±10）g，由濟(jì)寧魯抗實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物合格證編號(hào)3700920004220）。主食為顆粒型普通大鼠飼料，室溫為20～23℃，晝夜節(jié)律以燈光控制，明暗交替12 h/12 h，實(shí)驗(yàn)過程中大鼠攝食飲水過程由大鼠自行控制，不加人工干預(yù)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、輻射組、治療組。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制作將120只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，每組40只，分為對(duì)照組、輻射組、治療組。所有大鼠給予10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射，麻醉成功后，對(duì)照組僅擺體位，不給予射線照射，僅給予同劑量的藥物溶解介質(zhì)。其余2組，在鉛模保護(hù)下，采用直線加速器進(jìn)行垂直單次照射大鼠全腦，電子束6 Mev，劑量率300 cGy/min，照射源與大鼠體表距離30 cm。治療組建模成功后給予姜黃素腹腔注射，從建模第1天給予姜黃素100 mg/（kg·d）腹腔注射，第30天后應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和逃避跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測試各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。經(jīng)放射線照射后輻射組及對(duì)照組，腹腔注射相同體積的姜黃素溶劑MDSO作為安慰劑，各組分別在完成Morris水迷宮測試后各取10只處死行血腦屏障通透性檢測。其余大鼠取腦組織固定，石蠟切片，進(jìn)行組織病理及免疫組化染色。

1.2.2 行為學(xué)檢測跳臺(tái)逃避實(shí)驗(yàn)中，記錄每只大鼠5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)及逃避潛伏期作為學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，通過記錄原平臺(tái)象限停留時(shí)間、總路徑長度、逃避潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)評(píng)價(jià)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變。

1.2.3 血腦屏障通透性檢測每只大鼠經(jīng)左心室生理鹽水灌注、取腦、離心、取上清，采用分光光度計(jì)檢測吸光度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線查出大鼠腦組織伊文氏藍(lán)（Evans blue，EB）濃度，按公式計(jì)算腦組織EB含量（μg/g），EB含量＝EB 濃度（μg/mL）×3 mL（甲酰胺體積）/腦組織質(zhì)量（g）。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查方法采用多聚甲醛經(jīng)左心室灌注外固定鼠腦，每組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取20只，10只進(jìn)行海馬區(qū)石蠟切片測定膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），另10只進(jìn)行石蠟切片免疫組化染色測定環(huán)核苷酸-3′磷酸水解酶（cyclic nucleotide 3′phosphohydrolase，CNPase）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0軟件包進(jìn)行處理，多組間的比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較可用SNK檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 照射后大鼠一般情況對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)正常，進(jìn)食及飲水情況良好，動(dòng)作靈活，對(duì)刺激反應(yīng)迅速。輻射組大鼠表現(xiàn)為精神差，進(jìn)食飲水較對(duì)照組顯著減少，動(dòng)作遲緩，對(duì)刺激反應(yīng)較遲鈍，性格改變，兇悍、煩躁、相互攻擊，出現(xiàn)頭部照射區(qū)毛發(fā)脫落、稀疏，個(gè)別大鼠表現(xiàn)為呼吸急促，皮膚溫度下降。治療組在建模后3 d內(nèi)，出現(xiàn)精神差、行動(dòng)遲緩、飲食減少等表現(xiàn)，3～4 d后逐漸好轉(zhuǎn)，10 d左右恢復(fù)正常。

2.2 大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1 跳臺(tái)逃避實(shí)驗(yàn)造模后第30天，各組大鼠均行跳臺(tái)逃避試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)第1天大鼠錯(cuò)誤次數(shù)代表大鼠學(xué)習(xí)能力，實(shí)驗(yàn)第2天中，大鼠錯(cuò)誤次數(shù)及逃避潛伏期代表大鼠記憶能力。第1天實(shí)驗(yàn)中，輻射組較對(duì)照組錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，治療組較輻射組錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第2天實(shí)驗(yàn)中，輻射組大鼠逃避潛伏期較對(duì)照組顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加（P＜0.05）。治療組與輻射組比較，逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05），錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見表1。

表1 跳臺(tái)逃避實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Platform escape test result ±s

表1 跳臺(tái)逃避實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Platform escape test result ±s

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與輻射組比較，*P＜0.05

2.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)輻射組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯下降（P＜0.05），治療組較輻射組顯著提高（P＜0.05），說明射線對(duì)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有損害，而姜黃素可改善射線照射后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力（表2）。

表2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Morris water maze test result ±s

表2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Morris water maze test result ±s

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與輻射組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù)對(duì)照組輻射組治療組路徑長度（cm）1 079±71 1 909±158#1 192±131*40 40 40學(xué)習(xí)能力逃避潛伏期（s）44.50±3.84 79.75±3.51#41.67±4.17*錯(cuò)誤次數(shù)15.29±0.79 35.51±3.56#14.31±1.28*記憶能力停留時(shí)間（s）32.30±1.78 17.12±0.94#31.04±1.87*

2.3 血腦屏障通透性實(shí)驗(yàn)輻射組大鼠腦組織EB含量較對(duì)照組顯著增多（P＜0.05），治療組較輻射組EB含量顯著減少（P＜0.05），提示射線能夠損傷大鼠血腦屏障使其通透性增加，姜黃素對(duì)射線引起的RIB大鼠血腦屏障損傷有保護(hù)作用（表3）。

表3 各組大鼠腦組織EB含量Tab.3 EB content of brain tissue in each group ±s，μg/g

表3 各組大鼠腦組織EB含量Tab.3 EB content of brain tissue in each group ±s，μg/g

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與輻射組比較，*P＜0.05

2.4 大鼠海馬區(qū)HE染色對(duì)照組無明顯病理改變。輻射組可見不同程度的海馬及大腦皮層神經(jīng)元的變性，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃集，胞漿紅染，胞體萎縮，細(xì)胞內(nèi)可見空泡變性；可見白質(zhì)區(qū)組織結(jié)構(gòu)梳松、血管擴(kuò)張和血管周圍間隙擴(kuò)大等表現(xiàn)。姜黃素組細(xì)胞形狀規(guī)則，有層次感，未查見炎性細(xì)胞浸潤，無結(jié)締組織增生，與對(duì)照組比較差異不大。見圖1。

2.5 各組大鼠病理學(xué)變化

2.5.1 GFAP免疫組化染色結(jié)果在海馬區(qū)域中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜呈棕褐色，為陽性細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞密度高，胞體圓而飽滿，輪廓清晰，突起粗、長，均勻深染（圖2）。在200倍顯微鏡視野下，計(jì)數(shù)各組大鼠海馬區(qū)域內(nèi)的GFAP陽性細(xì)胞數(shù)。治療組與輻射組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輻射組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

圖1 大鼠腦組織HE染色Fig.1 HE staining of rats brain tissue（× 200）

圖2 GFAP免疫組化染色Fig.2 Immunnohistochemical staining of GFAP cells(×200)

2.5.2 大鼠海馬區(qū)CNPase免疫組化染色在200倍顯微鏡視野下，陽性細(xì)胞胞漿呈黃褐色，圓形或卵圓形，少數(shù)有短的、突起的胞體，細(xì)胞較密集，細(xì)胞界限不清（圖3）；在白質(zhì)區(qū)域表達(dá)強(qiáng)陽性，治療組與輻射組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輻射組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

圖3 CNPase免疫組化染色Fig.3 Immunnohistochemical staining of CNPase cells(×200)

表4 GFAP陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)Tab.4 Number of GFAP cells x s，個(gè)

表5 CNPase陽性灰度值Tab.5 Grave value of positive CNPase cells ±s

表5 CNPase陽性灰度值Tab.5 Grave value of positive CNPase cells ±s

注：與輻射組比較，*P＜0.05；與對(duì)照組比較，#P＜0.05

CNPase陽性灰度值0.30±0.02 0.86±0.04#0.30±0.01*組別對(duì)照組輻射組治療組例數(shù)10 10 10

3 討論

在我國，RIB成為放射治療后的嚴(yán)重遠(yuǎn)期并發(fā)癥之一，發(fā)病率可達(dá)3/10萬，病死率高達(dá)0.7/10萬，局部高發(fā)地區(qū)如廣東省高于世界平均水平40倍［2］。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前主要在血管損傷、神經(jīng)元及神經(jīng)干細(xì)胞損傷、免疫效應(yīng)等方面進(jìn)行探討［3］。本課題組早期實(shí)驗(yàn)研究及本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示輻射可引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的降低，這和國外研究［4］結(jié)果一致。

本課題組既往研究證實(shí)了姜黃素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞輻射后損傷有保護(hù)作用，且與Merk1/2信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)［5］，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)姜黃素對(duì)離體神經(jīng)干細(xì)胞放射性損傷也有保護(hù)作用。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，有關(guān)姜黃素作用機(jī)制的研究非常缺乏［6］。姜黃素為姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、清除自由基等多種功能，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等都具有藥理作用［7］。本次實(shí)驗(yàn)觀察到早期予以姜黃素治療后可顯著提高模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，治療組大鼠腦組織中EB含量明顯降低，證明姜黃素對(duì)促進(jìn)、改善模型鼠學(xué)習(xí)記憶功能、改善血腦屏障損傷的作用確實(shí)有效。內(nèi)皮細(xì)胞破壞是血腦屏障破壞的啟動(dòng)環(huán)節(jié)，腦損傷產(chǎn)生后釋放的炎癥因子可以增加其血腦屏障的通透性，血腦屏障通透性的增加使血液中白細(xì)胞在損傷腦組織中的聚集進(jìn)一步增加，從而加重炎癥反應(yīng)［8］。研究［9］顯示，姜黃素治療缺血性腦損傷的作用機(jī)制包括減輕氧化應(yīng)激引起的損傷、促進(jìn)受損傷血腦屏障的恢復(fù)。姜黃素保護(hù)血腦屏障的機(jī)制是否與之相同，還需進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)可觀察到輻射組大鼠腦組織GFAP表達(dá)明顯增加，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要成分，在細(xì)胞活化時(shí)可大量表達(dá)，能夠維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的結(jié)構(gòu)和功能，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損害時(shí)反應(yīng)活躍［10］。既往研究［11］顯示在腦組織接受射線的初期，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可在損傷區(qū)域周圍產(chǎn)生膠質(zhì)界膜，有利于損傷的恢復(fù)，但星形膠質(zhì)細(xì)胞過度膠質(zhì)化時(shí)，可形成機(jī)械屏障，阻礙神經(jīng)組織的結(jié)構(gòu)修復(fù)以及功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示射線可引起GFAP表達(dá)增加，與前人研究結(jié)果一致。星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生現(xiàn)象并不能完全發(fā)揮星形膠質(zhì)細(xì)胞的正常生理功能［12］，這可能是RIB大鼠血腦屏障破壞及學(xué)習(xí)記憶能力差的原因之一。經(jīng)姜黃素治療后GFAP表達(dá)明顯降低，推測姜黃素可通過下調(diào)GFAP的表達(dá)來減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，從而改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

實(shí)驗(yàn)中輻射組大鼠海馬區(qū)CNPase陽性灰度值較對(duì)照組明顯降低。CNPase為髓鞘的構(gòu)成成分，在形成髓鞘的早期即可出現(xiàn)，其在少突膠質(zhì)細(xì)胞中含量大約占髓鞘的一半，在少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷中起關(guān)鍵作用［13］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)放射性損傷前期研究中證實(shí)，血管及少突膠質(zhì)細(xì)胞受損傷在該病的發(fā)生與發(fā)展過程中起了主要作用，少突膠質(zhì)細(xì)胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)成髓鞘膠質(zhì)細(xì)胞，能夠合成髓磷脂包繞于神經(jīng)纖維的軸突從而形成髓鞘，損傷晚期較為典型的病理學(xué)特征是脫髓鞘改變以及蛋白質(zhì)凝固性壞死。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示射線可引起大鼠腦組織CNPase的表達(dá)降低，該結(jié)果與前人研究一致［14］，符合少突膠質(zhì)細(xì)胞的放射性損傷效應(yīng)［15］。本實(shí)驗(yàn)觀察到姜黃素組CNPase陽性灰度值較輻射組明顯增高，提示姜黃素可上調(diào)CNPase的表達(dá)，推測姜黃素通過上調(diào)CNPase的表達(dá)減輕少突膠質(zhì)細(xì)胞的脫髓鞘，從而起到對(duì)放射性損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，姜黃素對(duì)RIB大鼠血腦屏障有保護(hù)作用，并下調(diào)GFAP、上調(diào)CNPase的表達(dá)，可能是姜黃素改善RIB大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的途徑之一，為RIB的治療提供更多思路。但是，本實(shí)驗(yàn)未能闡明姜黃素通過何種機(jī)制調(diào)節(jié)GFAP、CNPase的表達(dá)，這將有待進(jìn)一步研究。

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