蛇床子素對睡眠剝奪大鼠記憶功能的影響

杜展鑫 唐珮瑜 謝煒基 潘曉佳 羅偉聰 陳棋棋 歐超然 梁建芬 朱曉琴

1廣州醫(yī)科大學(xué)（廣州511436），2廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心（廣州511436）

睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）是指某些原因?qū)е碌乃邥r(shí)間減少或睡眠質(zhì)量下降。睡眠剝奪后機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，大量產(chǎn)生的氧自由基和一氧化氮（NO）具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，可導(dǎo)致腦組織損害，造成記憶功能的損傷［1-4］。失眠癥發(fā)病率在中國高達(dá)10%～20%，已成為重要的公共衛(wèi)生問題之一。而目前臨床上常用的安眠藥長期服用可導(dǎo)致不同程度的成癮性、耐藥性與記憶損傷等。已有研究［5-6］表明蛇床子素（osthole，Ost）具有清除氧自由基、鎮(zhèn)靜催眠及促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶的作用，因此其在失眠癥的治療具有廣闊的應(yīng)用前景。而Ost的抗氧化應(yīng)激作用對睡眠剝奪大鼠的記憶功能的影響尚未明確，故本研究通過復(fù)制大鼠睡眠剝奪模型，探究Ost對睡眠剝奪模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與儀器Ost（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；BCA試劑盒（Bioworld Technology CO.，Ltd.）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化（SOD）與一氧化氮（NO）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；睡眠剝奪箱（參照文獻(xiàn)自制）；Morris水迷宮（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法成年雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量200～230 g，隨機(jī)分為4組：正常對照組（NC組）、大平臺(tái)組（TC組）、睡眠剝奪模型組（M組）與Ost組（25 mg/kg），每組12只。腹腔注射給藥，每天1次，連續(xù)7 d。采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法建立大鼠SD模型［7］。將M組和Ost組大鼠置于水箱中的小平臺(tái)剝奪睡眠72 h，TC組的大鼠置于水箱中的大平臺(tái)，NC組大鼠單籠飼養(yǎng)。SD 3 d后大鼠活動(dòng)增多，興奮性明顯提高，繼而出現(xiàn)睡眠晝夜節(jié)律不明顯，易激惹、嘶叫、攻擊，最后呈現(xiàn)出精神萎靡，對外界刺激反應(yīng)淡漠，進(jìn)食時(shí)達(dá)到睡眠狀態(tài)表明造模成功［7］。于給藥第3天開始行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶的訓(xùn)練與測試［8］。測試結(jié)束后處死大鼠，取下腔靜脈血，檢測血清中MDA與SOD的含量。斷頭取腦，取新鮮海馬，檢測海馬MDA、SOD和NO活性。取新鮮全腦行HE染色，光鏡觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ost對SD大鼠海馬組織MDA、SOD和NO的影響與NC、TC組比較，M組海馬組織的MDA和NO含量均升高（P＜0.05），SOD活力代償性增加（P＜0.01，P＜0.05）。Ost組大鼠海馬組織中MDA與SOD含量均低于M組（P＜0.05），但NO含量與M組無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠海馬組織MDA、SOD和NO含量檢測結(jié)果Tab.1 Results of MDA，SOD and NO content in mice hippocampus（n=12）±s

表1 各組大鼠海馬組織MDA、SOD和NO含量檢測結(jié)果Tab.1 Results of MDA，SOD and NO content in mice hippocampus（n=12）±s

注：與NC組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與M組比較，cP＜0.05，dP ＜ 0.01

組別NC組TC組M組Ost組MDA（nmol/mg）10.6±4.3 12.9±5.6c 26.5±9.4a 11.5±7.3d SOD（U/mg）62.8±37.3 79.9±50.5c 172.0±36.5b 82.6±25.9d NO（μmol/g）0.1±0.1 0.1±0.0c 0.7±0.3a 0.5±0.3a

2.2 Ost對SD大鼠血清MDA和SOD的影響與NC、TC兩組比較，M組血清MDA含量明顯增加（P＜0.05）。Ost組較M組血清MDA含量顯著減少（P＜0.05）。而各組間血清SOD含量無顯著性差異。見表2。

表2 各組大鼠血清MDA和SOD含量檢測結(jié)果Tab.2 Results of the content of MDA，SOD and NO in mice serum（n=12）±s

表2 各組大鼠血清MDA和SOD含量檢測結(jié)果Tab.2 Results of the content of MDA，SOD and NO in mice serum（n=12）±s

注：與NC組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與M組比較，cP＜0.05，dP ＜ 0.01

組別NC組TC組M組Ost組MDA（nmol/mL）20.1±3.5 15.4±7.8c 32.9±13.5a 10.1±7.0d SOD（U/mL）202.3±21.5 190.2±31.0 183.9±12.3 180.5±31.8

2.3 Ost對SD大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響與NC組和TC組比較，M組逃避潛伏期顯著增加而平臺(tái)穿越次數(shù)顯著減少（P＜0.01）。相比M組，Ost組大鼠逃避潛伏期縮短（P＜0.01）而穿越平臺(tái)次數(shù)增加（P＜0.05）。見表3。

2.4 Ost對海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)的影響CA1區(qū)錐體層神經(jīng)元的形態(tài)：NC組細(xì)胞輪廓清晰，胞漿透明，與NC組比較，M組細(xì)胞排列疏松紊亂，部分神經(jīng)元脫失，TC組細(xì)胞形態(tài)與其相似；與M組比較，TC組細(xì)胞排列較緊密，Ost組CA1區(qū)完整，錐體細(xì)胞數(shù)明顯增多，輪廓更清晰，細(xì)胞排列稍紊亂，細(xì)胞形態(tài)基本正常。見圖1。

3 討論

睡眠是個(gè)體生存發(fā)育所必需的一項(xiàng)重要生理活動(dòng)，而SD是研究睡眠機(jī)能的一個(gè)重要手段。研究表明，SD對認(rèn)知水平有很大影響，可通過多種途徑損傷海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，造成學(xué)習(xí)和記憶功能減退［1-2，9］，其中氧化應(yīng)激起著重要的作用［10］。睡眠剝奪后機(jī)體所處的高代謝狀態(tài)導(dǎo)致線粒體電子鏈傳遞時(shí)自由基產(chǎn)生增加，當(dāng)其超過抗氧化防御系統(tǒng)功能的上限即可引起氧化應(yīng)激。研究證實(shí)，SD可誘發(fā)海馬和血清氧自由基與海馬NO含量增加，同時(shí)造成海馬神經(jīng)元的損傷，使認(rèn)知能力顯著下降［3-4，11］。MDA 是脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物，其含量間接地反映了自由基的損害程度［12］。SOD是體內(nèi)天然存在的自由基清除的重要酶類，反映機(jī)體抗氧化和清除自由基的能力［13］。本研究通過檢測MDA和SOD的濃度以反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平。NO對睡眠-覺醒周期起著重要的調(diào)控作用，是睡眠調(diào)節(jié)因子發(fā)揮睡眠調(diào)節(jié)作用的共同通路［14］。過量的NO具有神經(jīng)毒性，通過促進(jìn)氧自由基的生成和釋放，誘發(fā)氧化應(yīng)激，并與氧自由基相互作用，產(chǎn)生細(xì)胞毒性［15］。TC組旨在探討改良多平臺(tái)法中水環(huán)境等應(yīng)激是否會(huì)對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力造成影響。

圖1 大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)（HE×200）Fig.1 Morphology of neuron in hippocampus CA1 of mice（HE × 200）

表3 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of Morris maze test of mice（n=12） ±s

表3 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of Morris maze test of mice（n=12） ±s

注: 與NC組比較，aP＜0.05，bP＜0.01; 與M組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別NC組TC組M組Ost組注:與NC組比較，aP＜0.05，bP＜0.01;與M組比較，cP＜0.05，dP＜0.01逃避潛伏期SD前48 h 42.2±20.0 43.7±14.2 55.7±20.7 45.2±19.0 SD前24 h 32.3±8.2 27.6±5.6 45.9±20.2 28.4±7.3 SD24 h 26.4±3.4 27.6±2.9c 35.6±15.6b 26.8±7.7d SD48 h 23.8±2.0 35.5±11.3c 44.3±20.5b 31.4±14.4d SD72 h 24.3±5.2 27.4±12.6c 27.5±2.3b 25.0±5.1d穿越平臺(tái)次數(shù)11.8±2.9 9.6±4.9c 4.6±1.5b 9.5±3.9c

Ost具有抗炎、清除氧自由基、腦保護(hù)、促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶、降低海馬組織NO含量以及促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖等作用［5-6，16］；其中，Ost可在自由基鏈反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)阻斷反應(yīng)的進(jìn)行，從而對抗自由基對細(xì)胞和組織的損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，M組大鼠海馬組織、血清中的MDA含量，以及海馬組織中的SOD活性均明顯高于NC組和TC組，說明SD后動(dòng)物腦內(nèi)自由基明顯增多，脂質(zhì)過氧化程度加重，可能為機(jī)體自由基清除系統(tǒng)代償性升高所致。與M組相比，Ost組海馬組織與血清的MDA水平顯著降低，海馬組織SOD活力明顯恢復(fù)，提示Ost具有抗氧化應(yīng)激的作用。相較NC組與TC組，M組大鼠海馬中的NO含量升高，而Ost組的NO含量與M組無顯著差異，提示Ost無降低SD后NO的神經(jīng)毒性作用。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SD 72 h可造成大鼠學(xué)習(xí)記憶的獲得和維持能力的下降，同時(shí)水刺激等應(yīng)激并不會(huì)對SD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力造成損害；而Ost可以有效減少SD所造成的學(xué)習(xí)和空間記憶功能損害。腦組織切片觀察結(jié)果提示Ost可減輕SD對海馬神經(jīng)元所造成的損害。

綜上所述，Ost可能通過降低海馬組織與血清中MDA含量，恢復(fù)海馬組織中SOD活性，減輕海馬組織神經(jīng)細(xì)胞的損害從而發(fā)揮對SD大鼠記憶功能的保護(hù)作用。其具體作用機(jī)制及影響因素仍需進(jìn)一步研究。

［1］LIM J，DINGES D F.A meta-analysis of the impact of short-term sleep deprivation on cognitive variables［J］.Psychol Bull，2010，136（3）：375-389.

［2］JACKSON M L，GUNZELMANN G，Whitney P，et al.Deconstructing and reconstructing cognitive performance in sleep deprivation［J］.Sleep Med Rev，2013，17（3）：215-225.

［3］IKEDA M，IKEDA-SAGARA M，OKADA T，et al.Brain oxidation is an initial process in sleep induction［J］.Neuroscience，2005，130（4）：1029-1040.

［4］陳莉弘.睡眠剝奪影響學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生報(bào)，2015，28（10）：1098-1101.

［5］HUANG W C，LIAO P C，HUANG C H，et al.Osthole attenuates lipid accumulation，regulates the expression of inflammatory mediators，and increases antioxidants in FL83B cells［J］.Biomed Pharmacother，2017，91：78-87.

［6］張曉平，陳新梅，崔清華，等.蛇床子素藥理作用及其相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國執(zhí)業(yè)藥師，2013，10（11）：28-32.

［7］何玉宏，王培歡，席蘭蘭，等.改良多平臺(tái)法建立大鼠部分睡眠剝奪模型及其效果評價(jià)［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2015，32（12）：1107-1111.

［8］SCHOENFELD R，SCHIFFELHOLZ T，BEYER C，et al.Variations of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation［J］.Neurobiol Learn Mem，2017，139：117-127.

［9］DUCLOS C，BEAUREGARD M P，BOTTARI C，et al.The impact of poor sleep on cognition and activities of daily living after traumatic brain injury：A review［J］.Aust Occup Ther J，2015，62（1）：2-12.

［10］SRINIVASAN P，DUR-ZONG H，F(xiàn)U Y H，et al.Sleep deprivation-induced multi-organ injury：role of oxidative stress and inflammation［J］.Excli J，2015，14（8）：672-683.

［11］HAVEKES R，ABEL T.The tired hippocampus：the molecular impact of sleep deprivation on hippocampal function［J］.Curr Opin Neurobiol，2017，44：13-19.

［12］NIIJIMA F，SAITO H，MURAI S，et al.Effect so fat omoxe-tine on level sofmonoamines and relted substances in discrete brain regions in mice intermittetly deprived of rapid eye movement sleep［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（4）：617-621.

［13］WEI L F，ZHANG H M，WANG S S，et al.Changes of MDA and SOD in brain tissue after secondary brain injury with seawater immersion in rats［J］.Turk Neurosurg，2016，26（3）：288-384.

［14 CHEN L，MAJDE J A，KRUEGER J M.Spontaneous sleep in mice with targeted disruptions of neuronal or inducible nitric oxide synthase genes［J］.Brain Res，2003，973（2）：214-222.

［15］ANDREY V KOZLOV，SOHEYL BAHRAMI，HEINZ REDL，et al.Alterations in nitric oxide homeostasis during traumatic brain injury［J］.BBA-Mol Basis Dis，2017，1863（10 Pt.B）：2627-2632.

［16］YUHUI YAN，LIANG KONG，YANG XIA，et al.Osthole promotes endogenous neural stem cell proliferation and improved neurological function through Notch signaling pathway in mice acute mechanical brain injury［J］.Brain Behav Immun，2017，67：118-129.