口腔鱗狀細(xì)胞癌病人唾液的代謝組學(xué)研究

(青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266003)

口腔惡性腫瘤是頭頸部最常見的惡性腫瘤，其中90%以上為鱗癌，以口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)最為常見，發(fā)病率占全身惡性腫瘤的第6位[1]。目前，治療OSCC的首選方法仍是綜合序列治療，治療后易復(fù)發(fā)，預(yù)后并不樂觀。研究表明，早期診斷并經(jīng)過治療后的口腔鱗癌病人5年生存率可超過80%[2]。但近一半的病人初診時(shí)病情已是中晚期，并伴有淋巴轉(zhuǎn)移[3]，故5年生存率僅為50%左右[4]。分子生物學(xué)研究證實(shí)，OSCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟過程[5]，包括基因突變、上皮單純性增生、上皮異常增生、原位癌、浸潤(rùn)癌等。目前臨床上對(duì)于OSCC的診斷主要是基于組織病理檢查，沒有無創(chuàng)、便捷、靈敏的診斷方法。代謝組學(xué)是近幾年興起的一項(xiàng)研究技術(shù)，與腫瘤表型特征關(guān)系較基因組學(xué)和蛋白組學(xué)更為緊密[6-8]。目前正在研究應(yīng)用于各種腫瘤發(fā)展過程中的代謝標(biāo)志物，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的早篩選、早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，這將對(duì)降低癌癥的發(fā)病率和死亡率有著重要的意義。本文研究應(yīng)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)臨床已確診的OSCC病人和健康人的唾液進(jìn)行代謝輪廓的研究，尋找與OSCC相關(guān)的潛在代謝標(biāo)志物，并通過代謝通路對(duì)其進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

甲醇(CNW Technologies公司，德國(guó))；氯仿、吡啶(Adamas公司，中國(guó))；甲氧銨鹽(TCI公司，日本)；L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技)；BSTFA(REGIS Technologies公司，美國(guó))；飽和脂肪酸甲酯(Dr. Ehrenstorfer公司，德國(guó))；7890A型氣相色譜(Agilent公司，美國(guó))；PEGASUS HT型質(zhì)譜儀(LECO公司，美國(guó))；DB-5MS型色譜柱(Agilent公司，美國(guó))；Heraeus Fresco17型離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；TNG-T98型真空干燥儀(華美生化儀器廠)；唾液采集管(SARSTEDT公司，德國(guó))。

1.2 研究對(duì)象與分組

青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科和口腔黏膜病科OSCC病人26例，男16例，女10例；年齡34～84歲，平均(59.8±11.9)歲。樣本采集均征得病人本人同意，并由術(shù)前病理檢查確定診斷。以20例健康志愿者作為正常對(duì)照組，男8例，女12例；年齡30～76歲，平均(57.6±11.8)歲。兩組性別、年齡比較差異無顯著性(P>0.05)。樣本采集前確保所有捐獻(xiàn)者口腔黏膜均無其他疾病并否認(rèn)全身系統(tǒng)性疾病，半年內(nèi)未服用免疫抑制劑，未行化療。所有研究對(duì)象均填寫知情同意書，并經(jīng)倫理委員會(huì)審核同意。

1.3 研究方法

1.3.1唾液樣本收集及代謝物提取 收集唾液樣本前告知病人2 h內(nèi)禁食、禁飲、禁煙。根據(jù)NAVAZESH的方法[9]，在上午9:00～11:00收集研究對(duì)象唾液樣本于唾液采集管中，2 000 r/min離心5 min，得到純凈的唾液樣本，置于-80 ℃保存。取200 μL唾液樣本加入0.3 mL提取液(甲醇)以及20 μL的L-2-氯苯丙氨酸，渦旋30 s，研磨儀處理4 min，冰浴超聲5 min；于4 ℃、13 000 r/min離心20 min；取0.4 mL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶(甲烷硅基化)中，每個(gè)樣本各取70 μL混合成質(zhì)控(QC)樣本；干燥提取物，加入20 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽，溶于20 g/L吡啶中)，放入80 ℃烘箱中30 min；分別向每個(gè)樣品中加入30 μL的BSTFA(含有體積分?jǐn)?shù)0.001的TMCS)，將混合物70 ℃孵育1.5 h；冷卻至室溫，加入5 μL飽和脂肪酸甲酯C8-C16(1 g/L)和C18-C24(0.5 g/L)；隨機(jī)順序上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2GC-TOF-MS數(shù)據(jù)采集 GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度280 ℃，離子源溫度250 ℃，以氦氣作為載氣，前進(jìn)氣流量2 mL/min，氣體流量1 mL/min，不分流，進(jìn)樣量2 μL。柱箱升溫程序：初始溫度50 ℃(保持1 min)，以10 ℃/min升至310 ℃(保持8 min)。MS條件：電子轟擊離子源溫度250 ℃，電子能量70 eV，接口溫度270 ℃，全掃描模式下在50～500 m/z范圍內(nèi)以每秒20個(gè)光譜的速率在溶劑延遲6.27 min后獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用四分位數(shù)間距對(duì)數(shù)據(jù)偏離值進(jìn)行過濾，對(duì)原始數(shù)據(jù)的缺失值進(jìn)行模擬，用內(nèi)標(biāo)歸一法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)處理。數(shù)據(jù)預(yù)處理后，使用SIMCA軟件進(jìn)行多元變量模式識(shí)別分析，運(yùn)用主成成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行建模分析，對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判；最后通過置換檢驗(yàn)對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn)。

1.5 差異代謝物的篩選及鑒定

根據(jù)OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP)>1、Student’st檢驗(yàn)的P值(P<0.05)尋找差異性代謝標(biāo)志物；通過檢索LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所尋找到的代謝標(biāo)志物進(jìn)行質(zhì)譜匹配及保留時(shí)間指數(shù)匹配，最后使用標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 GC-TOFMS數(shù)據(jù)分析結(jié)果

OSCC組和正常對(duì)照組的唾液樣本初步檢測(cè)出530個(gè)峰,數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾、標(biāo)準(zhǔn)化處理、利用內(nèi)標(biāo)(IS)進(jìn)行歸一化，334個(gè)峰被保留。兩組樣本的典型離子流色譜圖見圖1。為了區(qū)分OSCC組和正常對(duì)照組，對(duì)所有唾液樣品的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA建模分析，結(jié)果見圖2。由圖2可見，OSCC組與正常對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì)，說明兩組代謝譜間存在著明顯差異。置換檢驗(yàn)證明模型可靠，解釋模型的參數(shù)R2Y=0.858，表示模型預(yù)測(cè)能力的參數(shù)Q2=0.322，且無過擬合現(xiàn)象[10]。

2.2 差異代謝物鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定最終確定6個(gè)代謝差異物，包括尿酸、核糖、酪氨酸、植物鞘氨醇、二氫神經(jīng)鞘氨醇、對(duì)羥基乳酸。見表1。通過對(duì)以上得到的差異代謝物進(jìn)行層次聚類分析，并以熱力圖展示[11]，見圖3?？梢郧宄赜^察到6個(gè)代謝標(biāo)志物中，只有酪氨酸在OSCC組濃度較高，其余5個(gè)代謝標(biāo)志物在OSCC組濃度均較低，在正常對(duì)照組濃度均較高。見圖4。

3 討 論

代謝組學(xué)是通過觀察生物體受刺激或擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物的變化或代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的變化，來研究生物體代謝途徑的一種技術(shù)。過去10年中，代謝組學(xué)在乳癌、胰腺癌、鼻咽癌等癌癥的早期診斷中都有應(yīng)用，并受到全球范圍內(nèi)的關(guān)注[12]。有研究證實(shí)，即使對(duì)于癌癥早期和相對(duì)較小的腫瘤來講，其代謝譜與健康人群的差異也是非常明顯的。提示癌癥具有全身性的代謝反應(yīng)[13]。由于唾液樣本收集無創(chuàng)傷、易采集、與病人有良好的合作、沒有收集地點(diǎn)的限定、檢測(cè)敏感等優(yōu)點(diǎn)，更易被受試者接受[14]。

表1 經(jīng)實(shí)驗(yàn)鑒定的OSCC組區(qū)別于正常對(duì)照組的差異代謝物

圖1 兩組唾液樣本典型離子流色譜圖

橫坐標(biāo)t[1]P表示第一主成分的預(yù)測(cè)主成分得分，縱坐標(biāo)t[1]O表示正交主成分得分，散點(diǎn)形狀和顏色表示不同的實(shí)驗(yàn)分組。

橫坐標(biāo)C代表OSCC組，B代表正常對(duì)照組，不同的色塊代表對(duì)應(yīng)位置代謝物的相對(duì)表達(dá)量。

亮藍(lán)色標(biāo)記點(diǎn)為濃度下降趨勢(shì)，亮紅色標(biāo)記點(diǎn)為濃度升高趨勢(shì)。

本研究采用GC-TOF-MS的代謝組學(xué)方法對(duì)OSCC組與正常對(duì)照組的唾液樣本進(jìn)行分析，找出并鑒定了6種生物標(biāo)記物，分別為尿酸、核糖、酪氨酸、植物鞘氨醇、二氫神經(jīng)鞘氨醇、對(duì)羥基乳酸。據(jù)Warburg Effct效應(yīng)，與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞主要通過糖酵解作用而產(chǎn)生能量。在有氧的條件下，葡萄糖經(jīng)過糖酵解作用逐步分解生成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，TCA不僅是三大類物質(zhì)(糖類、脂類、蛋白質(zhì))的最終代謝通路，也是糖類、脂類、蛋白質(zhì)代謝甚至核酸代謝的聯(lián)系樞紐。本實(shí)驗(yàn)從熱力圖中可以直觀觀察到酪氨酸在OSCC組高表達(dá)，酪氨酸是由蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物苯丙氨酸轉(zhuǎn)換而成。腫瘤病人體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝較為復(fù)雜，總體表現(xiàn)為蛋白質(zhì)分解增加超過合成增加。作為蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，氨基酸的代謝也呈明顯紊亂，因此酪氨酸作為其分解代謝產(chǎn)物在OSCC病人唾液中濃度呈增高趨勢(shì)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，體內(nèi)及體外去除苯丙氨酸/酪氨酸均可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，使腫瘤細(xì)胞阻止于G0/G1期，同時(shí)可以降低周期素D1的表達(dá)[15]。由此推測(cè)，體內(nèi)酪氨酸與腫瘤有一定的相關(guān)性。本文酪氨酸代謝通路分析顯示，在該通路里酪氨酸經(jīng)過谷氨酸草酰轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.1)和酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(2.6.1.5)的協(xié)同作用后，共同調(diào)控其代謝產(chǎn)物對(duì)羥基乳酸，從而使對(duì)羥基乳酸的含量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。

本文結(jié)果顯示，OSCC唾液二氫神經(jīng)鞘氨醇和植物鞘氨醇濃度均呈下調(diào)趨勢(shì)，這與WANG等[16]的研究結(jié)果相似。二氫神經(jīng)鞘氨醇和植物鞘氨醇均與神經(jīng)酰胺的合成和代謝有關(guān)，神經(jīng)酰胺為鞘脂的代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞信號(hào)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老和細(xì)胞程序性死亡等許多重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。脂代謝紊亂與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。惡性腫瘤細(xì)胞增殖時(shí)，膽固醇的攝取量增多、合成加速。二氫神經(jīng)鞘氨醇作為抑制低密度脂蛋白誘導(dǎo)膽固醇酯化的阻滯劑，引起未酯化的膽固醇積聚在細(xì)胞核周區(qū)；同時(shí)，植物鞘氨醇在結(jié)構(gòu)上類似于鞘氨醇。因此，OSCC病人唾液中二氫神經(jīng)鞘氨醇和植物鞘氨醇濃度均呈下調(diào)趨勢(shì)。提示這些具有生物活性的鞘脂代謝物有望成為OSCC的生物標(biāo)志物。

尿酸是由核酸的中間代謝產(chǎn)物嘌呤核苷酸在黃嘌呤作用下轉(zhuǎn)換而成。其中，嘌呤核苷酸在機(jī)體的能量供應(yīng)和代謝調(diào)節(jié)等方面都有十分重要的意義。核酸作為生命活動(dòng)的基本物質(zhì)之一，儲(chǔ)存在人體細(xì)胞的細(xì)胞核和線粒體中，由RNA和DNA兩部分構(gòu)成，在機(jī)體的生長(zhǎng)和遺傳等生命活動(dòng)過程中起著至關(guān)重要的作用。在腫瘤病人核酸代謝的過程中，DNA和RNA聚合酶活性均較正常組織高，由于核酸代謝明顯降低，從而導(dǎo)致尿酸濃度也明顯降低，因此，尿酸的濃度在OSCC病人唾液中呈下調(diào)趨勢(shì)。核糖是核酸的基本構(gòu)成單位，其濃度在OSCC病人唾液中也呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從代謝角度提示尿酸和核糖作為OSCC代謝標(biāo)志物的潛在可能性。

綜上所述，應(yīng)用代謝組學(xué)研究方法，從OSCC病人唾液中成功篩選出6種口腔鱗癌唾液代謝標(biāo)志物；相關(guān)代謝通路分析顯示，OSCC病人與健康人群相比存在著氨基酸代謝和能量代謝紊亂以及脂類代謝失衡的現(xiàn)象，還表現(xiàn)出TCA異常。由于本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量有限，導(dǎo)致了此次實(shí)驗(yàn)的局限性，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要通過更多的實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行驗(yàn)證，若今后研究同時(shí)結(jié)合血液樣本和尿液樣本，可以得到更加完善的代謝圖譜，這將為OSCC的診斷提供可靠的代謝證據(jù)，為將來的臨床工作提供有效的幫助。

[參考文獻(xiàn)]

[1] WARNAKULASURIYA S. Global epidemiology of oral and oropharyngeal Cancer[J]. Oral Oncology, 2009,45(4/5):309-316.

[2] CANDIOTA A P, MAJS C, JULI-SAPé M, et al. Non-invasive grading of astrocytic tumours from the relative contents of myo-inositol and glycine measured by in vivo MRS[J]. JBR-BTR, 2011,94(6):319-329.

[3] CHENG Y s-l. Advances in diagnostic adjuncts for oral squamous cell carcinoma[J]. Open Pathology Journal, 2011,5(1):3-7.

[4] FUNK G F, KARNELL L H, ROBINSON R A, et al. Pre-sentation, treatment, and outcome of oral cavity cancer: a National Cancer Data Base report[J]. Head Neck, 2002,24(2):165-180.

[5] JESSRI M, DALLEY A J, FARAH C S. MutSα and MutLα immunoexpression analysis in diagnostic grading of oral epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol, 2015,119(1):74-82.

[6] KALMAR J R. Advances in the detection and diagnosis of oral precancerous and cancerous lesions[J]. Oral Maxillofac Surg Clin North Am, 2006,18(4):465-482.

[7] DIXON R A, GANG D R, CHARLTON A J, et al. Applications of metabolomics in agriculture[J]. J Agric Food Chem, 2006,54(24):8984-8994.

[8] HERMAN C, CETINGUL M P. Quantitative visualization and detection of skin Cancer using dynamic thermal imaging[J]. J Vis Exp, 2011,51(51): e2679-e2679.

[9] NAVAZESH M. Methods for collecting saliva[J]. Ann N Y Acad Sci, 1993,694(1):72-77.

[10] SACCENTI E, HOEFSLOOT H J, SMILDE A K, et al. Reflections on univariate and multivariate analysis of metabolomics data[J]. Metabolomics, 2014,10(3):361-374.

[11] KOLDE R. Pheatmap: Pretty heatmaps [J]. R Package Version, 2012:61.

[12] BONNE N J, WONG D T. Salivary biomarker development using genomic, proteomic and metabolomic approaches[J]. Genome Med, 2012,4(10):82-85.

[13] TIZIANI S, LOPES V, GUNTHER U L. Early stage diagnosis of oral Cancer using 1H NMR-based metabolomics[J]. Neoplasia (New York, N.Y.), 2009,11(3):269-276.

[14] TABAK L A. A revolution in biomedical assessment: The development of salivary diagnostics[J]. J Dent Educ, 2001,65(12):1335-1339.

[15] FU Y M, YU Z X, FERRANS V J, et al. Tyrosine and phe-nylalanine restriction induces G0/G1cell cycle arrest in murine melanoma in vitro and in vivo[J]. Nutr Cancer, 1997,29(2):104-113.

[16] WANG Q H, GAO P, WANG X Y, et al. The early diagnosis and monitoring of squamous cell carcinoma via saliva metabolomics[J]. Sci Rep, 2014,4(4):6802-6809.