lncRNA CASC2c通過ERK1/2和Wnt/β-catenin信號通路對胃癌細胞SGC-7901增殖及遷移的影響

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內(nèi)科； 2 中心實驗室； 3 心臟超聲科)

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是世界第二大死亡相關(guān)腫瘤[1-2]。胃癌是一種復(fù)雜的遺傳性相關(guān)性疾病，已經(jīng)證實了多種基因與胃癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，包括致癌基因或抑癌基因[3-4]。盡管最近在手術(shù)、放療和化療等治療策略上取得了進展，但胃癌的預(yù)后仍然很差[5]。我國目前仍面臨著早期胃癌檢出率低的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，闡明胃癌發(fā)生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物以及開展新的靶向治療方法顯得至關(guān)重要。

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是長度大于200個核苷酸的但不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA[6-9]。全基因組轉(zhuǎn)錄組研究(RNA測序、基因芯片與平鋪陣列)已發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計的非編碼RNA[10-11]。目前的研究已經(jīng)證實lncRNAs可以參與許多重要的生物過程，如基因組印記[12]、染色體構(gòu)象變化及酶活性的的變構(gòu)調(diào)節(jié)等[13-14]。另外lncRNA的表達還可以調(diào)控細胞分化狀態(tài)。更重要的是，lncRNA的過度表達或突變或缺失可以導(dǎo)致多種人類疾病的發(fā)生[15]。但是，目前對大多數(shù)lncRNAs的具體功能仍然是未知的，而且很多l(xiāng)ncRNA可能并不存在實際的意義。lncRNA CASC2位于第10號染色體短臂26號位，是由BALDINU等[16]在子宮內(nèi)膜癌中首次發(fā)現(xiàn)。BALDINU等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CASC2通過可變性剪切形成3個轉(zhuǎn)錄變異體，分別為CASC2a、CASC2b和CASC2c。BALDINU等[17]研究還顯示，CASC2a在子宮內(nèi)膜癌中呈低水平表達，通過進一步的研究顯示，CASC2a在子宮內(nèi)膜癌中很可能發(fā)揮腫瘤抑制的作用。此外，HE等[6]發(fā)現(xiàn)CASC2a/b在非小細胞肺癌中也呈低水平表達，并且CASC2a/b表達水平的高低與非小細胞肺癌病人的預(yù)后相關(guān)。另外PEI等[18]研究顯示，CASC2a/b在膀胱癌病人中表達水平明顯降低，而升高CASC2a/b后可以抑制膀胱癌細胞的增殖。但是，目前很少有關(guān)于CASC2c對癌癥的影響的研究，本實驗通過篩選出與胃癌相關(guān)的lncRNA CASC2c，探討CASC2c對胃癌增殖和遷移的影響，以及在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料來源

選取2014年4月-2015年3月在我院確診的胃癌病人的癌組織及相鄰的正常組織標(biāo)本36例。36例病人中男26例，女10例；年齡42～81歲，平均(60.3±9.8)歲。病人術(shù)前均未曾接受過輔助治療。組織標(biāo)本RNA提取后立即置于-80 ℃保存。病人同意參與本研究，取樣過程在我院倫理委員會監(jiān)督下進行。

1.2 細胞培養(yǎng)

胃癌細胞SGC-7901及正常人源胃細胞GSE-1細胞均購于美國細胞庫(ATCC)。細胞培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)0.10的BI(Biological Industries, Cromwell, CT, USA)胎牛血清的DMEM混合培養(yǎng)液，細胞置于37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)獲取人源CASC2c序列。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，采用HotStarTaq DNA聚合酶(QIAGEN, Valencia, CA, USA)擴增CASC2c完整序列。利用DNA連接酶將其插入載體質(zhì)粒pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的KpnI和XbaI位點之間，以構(gòu)建過表達載體pcDNA-CASC2c。引物序列如下：上游引物5′-CGGGGTACCCCGGGAGAACAGGATGGCCATGT-3′，下游引物5′-TGCTCT-AGAGCAGCCTTCTCCATGTTGGTCTC-3′。待細胞融合達到80%時使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(Invitrogen公司，美國)轉(zhuǎn)染過表達載體pcDNA-CASC2c。通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 RT-qPCR檢測胃癌組織及細胞系中CASC2c的表達

采用RNAiso Plus(TaKaRa, Shiga,Japan)分別提取實驗組(胃癌組織及胃癌細胞SGC-7901)以及對照組(相鄰正常胃組織和正常胃細胞GSE-1)中的總RNA，采用分光光度計檢測RNA的濃度以及純度。利用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa, Shiga, Japan)將其逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA(cDNA)。以cDNA為模板，按照SYBR GREEN EX TaqTM(TaKaRa, Shiga, Japan)說明書要求的反應(yīng)體系和反應(yīng)時間在LightCycler 480上進行RT-qPCR，所有實驗結(jié)果重復(fù)3次，結(jié)果以2-△△CT計算并進行統(tǒng)計分析。實驗以GAPDH作為內(nèi)參基因。CASC2c上游引物：5′-TTCCTCTCCCCTTTGGACTT-3′，下游引物：5′-TCTGCTTCTGCTGCTGTTGT-3′；GAPDH上游引物：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.5 采用Western blot檢測細胞中各蛋白的表達

用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解實驗組SGC-7901細胞(轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC2c)和對照組SGC-7901細胞(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)，裂解產(chǎn)物于100 ℃煮10 min，期間每隔3 min劇烈震蕩裂解產(chǎn)物以打斷DNA。使用BCA法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳后以0.3 A恒定電流濕法轉(zhuǎn)膜1.5 h，以50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h。4 ℃一抗溫育過夜，TBST洗3次，每次10 min。然后二抗室溫孵育1 h。所需抗體為：Anti-p-ERK1/2、Anti-T-ERK1/2、Anti-β-catenin、Anti-GAPDH，均購自于CST(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)公司。蛋白條帶使用vilber Lourmat(Eberhardzell, Germany)成像系統(tǒng)進行掃描分析。

1.6 采用CCK8實驗檢測細胞增殖能力

取生長狀況良好的轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC2c的胃癌細胞SGC-7901(實驗組)和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的胃癌細胞SGC-7901(對照組)。細胞接種于96孔板(2 000個細胞/孔)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入新鮮配制的無血清培養(yǎng)基110 μL(含10 μL CCK8檢測液)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min左右以后，用酶標(biāo)儀檢測細胞在450 nm波長處的吸光度(A)值，分別檢測0、24、48、72以及96 h細胞增殖數(shù)目變化。

1.7 采用Transwell細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力

取生長狀況良好的轉(zhuǎn)染pcDNA-CASC2c的胃癌細胞SGC-7901(實驗組)和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的胃癌細胞SGC-7901(對照組)。細胞接種在裝有小室的6孔板中，每組設(shè)置2個復(fù)孔。胃癌細胞SGC-7901懸浮在無血清培養(yǎng)基的上室(約100 000個細胞/孔)(8 μm孔徑；BD Biosciences, San Jose, CA, USA)，下室為500 μL含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液。24 h后，用棉簽輕輕地拭去上室表面的細胞(即未侵入下室的細胞)，侵入下室的細胞采用甲醇固定，然后用結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野(包括膜的中央和周邊)，計數(shù)侵入下室的細胞數(shù)目。

2 結(jié) 果

2.1 CASC2c在胃癌組織以及胃癌細胞中的表達比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，CASC2c在胃癌組織及相鄰的正常胃組織中的相對表達量分別為1 510.371±1 311.034和3 769.740±3 023.203，兩者比較差異有顯著性(t=3.651，P<0.05)；CASC2c在胃癌細胞SGC-7901和正常胃細胞GSE-1中的相對表達量分別為0.240±0.110和1.170±0.150，兩者比較差異有顯著性(t=2.366，P<0.05)。

2.2 過表達CASC2c對胃癌細胞增殖以及遷移的影響

CCK8細胞增殖實驗的結(jié)果顯示，pcDNA-CASC2c誘導(dǎo)CASC2c高表達0、24、48、72及96 h后，實驗組SGC-7901細胞在450 nm波長處的吸光度值分別為0.025±0.000，0.640±0.020，0.736±0.028，1.087±0.040，1.325±0.028；對照組SGC-7901細胞在450 nm波長處的吸光度值分別為0.025±0.000，0.733±0.140，0.861±0.030，1.317±0.061，1.536±0.045。與對照組比較，實驗組SGC-7901細胞在24、48、72及96 h增殖能力降低，兩組比較差異有顯著性(t=3.283～18.910，P<0.05)。Transwell實驗結(jié)果顯示，實驗組及對照組胃癌細胞SGC-7901穿過小室的數(shù)目分別為8.400±3.280和16.400±3.920，兩組比較差異具有顯著性(t=2.821，P<0.05)。

2.3 過表達CASC2c對p-ERK1/2和β-catenin表達量的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組p-ERK1/2及β-catenin的表達降低，兩組比較差異具有顯著性(t=8.538、5.667，P<0.05)；兩組T-ERK1/2表達水平比較，兩組比較差異無顯著意義(t=2.718，P>0.05)。見圖1，表1。

分組p-ERK1/2T-ERK1/2β-catenin對照組0.71±0.220.64±0.040.34±0.02實驗組0.29±0.090.57±0.060.20±0.04

圖1 不同處理組胃癌細胞SGC-7901中各種蛋白的表達

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[19]。相關(guān)功能研究表明，某些lncRNAs可以參與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展，并發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。例如，MO等[20]研究顯示，lncRNA XIST在胃癌組織和細胞系中高表達，并且可以促進癌細胞生長；而YUAN等[21]研究顯示，lncRNA DANCR通過阻遏CTNNB1的表達從而起到抑制胃癌生長的作用。然而，由于lncRNA序列和空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，更多的lncRNAs的功能、作用機制和臨床意義尚不完全清楚，有待進一步的深入研究。

lncRNA CASC2通過可變性剪接從而產(chǎn)生CASC2a、CASC2b和CASC2c 3個轉(zhuǎn)錄體。以往的研究顯示，CASC2a/b參與多種惡性腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展過程，包括胃細胞癌和結(jié)直腸癌等，例如CASC2a/b可以作為內(nèi)源性的RNA競爭性結(jié)合miR18a，抑制miR18a的表達，從而抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖[22]。雖然CASC2c與CASC2a/b序列之間存在較大的差異，但是目前關(guān)于CASC2c對癌癥影響的研究卻鮮有報道。因此在本實驗中，我們著重進行轉(zhuǎn)錄體CASC2c在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用研究。

在本實驗中，通過RT-qPCR檢測已經(jīng)證明CASC2c在胃癌組織及胃癌細胞中低表達，在一定程度上證明了CASC2c與胃癌病理過程的相關(guān)性。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們繼而研究了CASC2c對胃癌細胞生物學(xué)特性的影響及具體作用機制。利用CCK-8法檢測胃癌細胞增殖能力，Transwell實驗檢測胃癌細胞遷移能力。細胞學(xué)實驗結(jié)果顯示，CASC2c表達水平的升高可以抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖和遷移。細胞學(xué)實驗進一步證明了CASC2c與胃癌的相關(guān)性，說明CASC2c在胃癌的病理過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。在確定CASC2c對胃癌細胞生物學(xué)特性的影響之后，闡述這一影響的具體作用機制成為我們接下來的研究重點。大量的研究報道已經(jīng)證實，諸多信號通路(如mTOR信號通路)在各種細胞事件中發(fā)揮著關(guān)鍵作用：包括調(diào)節(jié)基因表達、生長、代謝、凋亡和轉(zhuǎn)移。本研究采用Western blot方法篩選CASC2c與信號通路之間的相互關(guān)聯(lián)性。Western blot檢測的結(jié)果顯示，誘導(dǎo)CASC2c的表達后能夠使p-ERK1/2和β-catenin的表達水平下調(diào)。p-ERK1/2和β-catenin分別為ERK1/2和Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵分子，而ERK1/2表達水平降低表示ERK1/2信號通路處于失活狀態(tài)。因此推測，CASC2c可能可以抑制ERK1/2和Wnt/β-catenin信號通路的活化。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，CASC2c在胃癌組織和胃癌細胞中低表達，過表達后可通過失活ERK1/2和Wnt/β-catenin信號通路而抑制胃癌細胞增殖和遷移，證實CASC2c對胃癌的發(fā)病具有抑制作用，此為胃癌早期診斷和治療提供了新的思路。

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