高氧對(duì)新生大鼠腦組織中NRP-cGMP信號(hào)通路的影響

張書劍，張有辰，李慧文，金正勇

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 延吉 133000)

隨著我國兒科學(xué)的發(fā)展及各省市新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的相繼建立，早產(chǎn)兒的存活率有明顯提高，但神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患兒比例卻大大增加。在眾多致病因素中，產(chǎn)后常壓高濃度吸氧引起的腦損傷逐年增多，已成為近年來新生兒科醫(yī)師亟待解決的問題[1]。研究[2-3]顯示：新生兒期長時(shí)間吸入高濃度氧氣可引發(fā)遠(yuǎn)期遲發(fā)性認(rèn)知功能障礙及學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動(dòng)功能損害等。新生兒高氧腦損傷的發(fā)生機(jī)制尚未明確，可能由炎性水腫、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)重建、新生血管重塑和組織細(xì)胞修復(fù)異常等多種因素共同作用引起。Brehmer等[4]研究表明：長時(shí)間高濃度氧(高氧)暴露將增加氧自由基產(chǎn)生，進(jìn)而啟動(dòng)氧化應(yīng)激途徑致神經(jīng)元受損，與此同時(shí)機(jī)體釋放大量促炎癥因子，進(jìn)一步加重腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷、凋亡和壞死。鈉尿肽(natriuretic peptides，NPs)作為一組參與機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的多肽，與靶細(xì)胞膜上特異性鈉尿肽受體(natriuretic peptide receptors，NPRs)結(jié)合，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，參與組織中環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的合成，調(diào)節(jié)機(jī)體一系列重要生理功能和反應(yīng)[5]。近年來研究[6]證實(shí)：在腦組織神經(jīng)細(xì)胞中能定位到NPRs的存在，但目前尚無足夠的證據(jù)顯示何種通路參與高氧腦損傷。本研究復(fù)制新生大鼠高氧誘導(dǎo)腦損傷模型，探討NRP-cGMP信號(hào)通路是否參與高氧誘導(dǎo)腦損傷的發(fā)病過程，為臨床診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 新生健康Wistar大鼠60只，大鼠出生體質(zhì)量5～9 g，雌雄兼有，購自延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)碼：SYXK(吉)(2007-0011)，大鼠均在延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)中心飼養(yǎng)。蘇木素染液和伊紅染液購自北京Solarbio科技公司，Reagent 1 and Reagent 2購自北京ZSGB-Bio 公司，NPR-A(H-125)抗體和NPR-B(H-80)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，cGMP ELISA試劑盒購自英國 Abbexa公司。低速離心機(jī)(TGL-16)購自湘南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Ra公司。

1.2 新生大鼠高氧誘導(dǎo)腦損傷模型的制備 參照文獻(xiàn)[7]復(fù)制高氧誘導(dǎo)新生大鼠腦損傷模型。將60只新生Wistar大鼠于出生后12 h內(nèi)編排序號(hào)，并隨機(jī)分為對(duì)照組和高氧模型組，每組30只。高氧模型組：將新生大鼠置于自制高氧箱內(nèi)，活動(dòng)空間、鼠糧和水源充足，有機(jī)玻璃箱頂端接入氧氣管，以2 L·min-1速度持續(xù)吸入醫(yī)用氧氣，每日用電子測(cè)氧儀檢測(cè)箱內(nèi)氧濃度，保持氧濃度>85%，箱底墊鈉石灰吸收CO2。對(duì)照組：除吸入空氣(氧氣濃度為21%)外，其他條件與高氧模型組相同。2組大鼠均連續(xù)吸入7 d。2組大鼠置于同一室內(nèi)，玻璃箱與室內(nèi)溫度均為23℃～26℃，室內(nèi)濕度為60%～70%，每日開箱20 min，觀察并記錄大鼠的一般情況，稱體質(zhì)量，更換飼料和墊料。對(duì)照組和高氧模型組每日互換哺乳母鼠，避免高氧模型組中母鼠因氧氣中毒，導(dǎo)致應(yīng)激性反應(yīng)，從而引起實(shí)驗(yàn)誤差。

1.3 2組大鼠腦組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)觀察 于實(shí)驗(yàn)第1、3和7天時(shí)，每組各取10只新生大鼠以10%水合氯醛0.7 mL灌腸麻醉后，固定于解剖臺(tái)上,充分暴露心臟和肝臟，剪開左心室，于心尖部進(jìn)針，快速將0.9%生理鹽水滴注，將膨脹的右心耳剪開，改用4%多聚甲醛灌注，撥開頭蓋骨，取出腦組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h，經(jīng)流水清洗過后,再次梯度酒精逐步脫水,之后二甲苯透明2次,制作石蠟包埋，沿腦組織矢狀面切片，選取半月形白色區(qū)域，即腦組織的海馬區(qū)。切片后行HE染色，光鏡下觀察2組大鼠腦組織形態(tài)表現(xiàn)。

大腦海馬組織以2.5%戊二醛固定后，經(jīng)1%餓酸后固定、丙酮脫水、浸透與樹脂包埋等制樣、進(jìn)行電鏡聚合塊的半薄切片，定位超薄切片70 nm，經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后于透射電子顯微鏡下觀察并照相。

1.4 Western blotting法檢測(cè)2組大鼠腦組織中鈉尿肽受體A(NPR-A)和鈉尿肽受體B(NPR-B)表達(dá)水平 取大鼠腦組織放入離心管中勻漿、反復(fù)剪碎，提取相關(guān)組織蛋白，采用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠后上樣、電泳，低溫轉(zhuǎn)膜300 mA，40 min后關(guān)閉，采用TBS-T震蕩清洗封閉后的PVDP膜，分別滴加一抗、二抗(最終濃度稀釋比例為1∶2 000)后室溫?fù)u床孵育，暗室中顯影。X線曝光后依次顯影、搖洗、沖洗和曬干。 采用Western blotting法測(cè)定其灰度值/并以β-actin條帶作為參照物。NPR-A表達(dá)水平=NPR-A目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值，NRP-B表達(dá)水平=NPR-B目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.5 ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織中cGMP水平 取適量大鼠腦組織制備勻漿液，Polytron-type試劑處理后離心，取上清液待測(cè)。將cGMP標(biāo)準(zhǔn)品加入HCl溶液中制備cGMP工作液。在0.6 mL離心管中加入cGMP工作液，其余離心管中加入HCl溶液后，連續(xù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，每孔依次加樣、中和液、乙酰化試劑后溫育10 min，加入乙?；?cGMP液、cGMP抗體和cGMP-HRP溫育1 h后洗滌5次，均勻加入HRP developer，溫育1 h，終止反應(yīng)。測(cè)定450 nm處吸光度(A)值，以A值代表cGMP水平。

2 結(jié) 果

2.1 2組大鼠體質(zhì)量 對(duì)照組新生大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中精神狀態(tài)較好、好動(dòng)、皮下脂肪豐富、呼吸均勻，生長發(fā)育良好；高氧模型組大鼠隨著氧氣暴露時(shí)間的延長，精神狀態(tài)較差、不易動(dòng)、皮膚干燥、體質(zhì)量增長慢，甚至出現(xiàn)腦神經(jīng)系統(tǒng)損害表現(xiàn)，如爬行姿勢(shì)不穩(wěn)、發(fā)育遲緩和驚厥等。對(duì)照組和高氧模型組新生大鼠體質(zhì)量隨著時(shí)間的延長而升高，與對(duì)照組比較，高氧暴露1、3和7 d高氧模型組新生大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量

GroupBody weight(t/d) 137Control6.15±0.1710.36±0.4117.43±0.45Hyperoxia model5.07±0.21*8.32±0.31*13.10±0.29*

*P<0.05 compared with control group.

2.2 各組大鼠腦組織形態(tài)表現(xiàn) 對(duì)照組新生大鼠高氧暴露1、3和7 d時(shí)，腦組織海馬錐體細(xì)胞排列整齊，層次緊密、豐富，形態(tài)正常，錐體細(xì)胞核圓而豐滿，核仁清晰，神經(jīng)纖維密集，胞質(zhì)豐富，呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色。高氧暴露3 d時(shí)，高氧模型組大鼠可見海馬錐體細(xì)胞體積縮小，排列稀疏；高氧暴露7 d時(shí)，高氧模型組大鼠海馬細(xì)胞出現(xiàn)深染皺縮，細(xì)胞與周圍分界不清，核固縮深染。見圖1(插頁一)。

2.3 透射電鏡下2組大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu) 電鏡下，高氧暴露1 d時(shí)，對(duì)照組清晰可見線粒體雙側(cè)膜和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)以及少許突觸。隨著時(shí)間的推移，可見高爾基復(fù)合體，突觸的數(shù)量、結(jié)構(gòu)(突觸間隙、突觸小泡、致密物質(zhì))增加，突觸間隙無明顯變化，可檢測(cè)到少許致密物質(zhì)。與對(duì)照組比較，高氧暴露1 d時(shí)，高氧模型組無明顯差異；高氧暴露3 d時(shí)，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)破壞，少許嵴消失，線粒體和突觸數(shù)量減少，隨著氧氣暴露時(shí)間的延長，突觸和小囊泡數(shù)目進(jìn)一步減少，突觸致密物密度降低。見圖2。

2.4 2組大鼠腦組織中NPR-A和NPR-B水平 高氧模型組大鼠腦組織中NPR-A水平高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著高氧暴露時(shí)間延長而增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。僅高氧暴露1 d時(shí)2組大鼠腦組織中NPR-B水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高氧暴露3和7 d時(shí)2組大鼠腦組織中NPR-B水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表2。

A-C：Control group；D-E：Hyperoxia model group. A，D：1 d after hyperoxia exposure；B，E：3 d after hyperoxia exposure；C，F(xiàn)：7 d after hyperoxia exposure.

圖2 2組大鼠腦組織中海馬椎體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(×12 000)

Fig.2 Ultrastructures of hippocampus cells in brain tissue of rats in two groups(×12 000)

Lane 1-3：Control group；Lane 4-6：Hyperoxia group;Lane 1， 4：1 d after hyperoxia exposure； Lane 2， 5：3 d after hyperoxia exposure； Lane 3， 6：7 d after hyperoxia exposure.

圖3 2組大鼠腦組織中NPR-A和NPR-B表達(dá)電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of NPR-A and NPR-B in brain tissue of rats in two groups

2.5 2組大鼠腦組織中cGMP水平 對(duì)照組新生大鼠腦組織中cGMP水平隨著大鼠日齡的增加而升高。與對(duì)照組比較，高氧暴露1、3和7 d時(shí)，高氧模型組大鼠腦組織中cGMP水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

3 討 論

新生兒期常壓高濃度吸氧可明顯改善早產(chǎn)兒因呼吸窘迫引起的缺氧狀態(tài)，對(duì)于低氧血癥、缺血缺氧性腦病的治療效果尤為顯著[8]，但是長時(shí)間常壓高濃度吸氧對(duì)機(jī)體有一定的不良反應(yīng)。研究[9-10]表明：早產(chǎn)兒各組織和器官發(fā)育極不成熟，對(duì)高氧引起的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等特別敏感，常見并發(fā)癥主要包括肺損傷、視器損傷及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等，其中腦組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是造成圍生期新生兒傷殘及死亡的主要因素之一，臨床上常表現(xiàn)為驚厥、腦水腫、昏迷、腦癱、語言及視力發(fā)育障礙等。近年來，高氧暴露產(chǎn)生的體內(nèi)代謝產(chǎn)物—活性氧被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞損傷的主要原因，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)受損會(huì)導(dǎo)致腦能量代謝改變，氧化應(yīng)激、炎癥、損傷和修復(fù)過程會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和分化障礙。在諸多哺乳動(dòng)物中，新生大鼠的腦組織神經(jīng)結(jié)構(gòu)與早產(chǎn)兒最為接近，高氧暴露后其腦組織病理變化也十分相似[11-12]。與新生兒大腦的發(fā)育過程比較，哺乳動(dòng)物的大腦存在發(fā)育滯后現(xiàn)象，產(chǎn)后1 d新生大鼠相當(dāng)于孕18～20周胎兒，產(chǎn)后2 d大鼠相當(dāng)于孕20～24周胎兒，產(chǎn)后3 d大鼠相當(dāng)于孕24～28周出生的早產(chǎn)兒，產(chǎn)后5 d大鼠相當(dāng)于28～32周出生的早產(chǎn)兒。因此，本實(shí)驗(yàn)選用出生后12 h內(nèi)新生大鼠模擬新生兒期長時(shí)間常壓高濃度氧療環(huán)境，復(fù)制新生大鼠高氧誘導(dǎo)腦損傷模型。本研究結(jié)果顯示：高氧模型組新生大鼠長時(shí)間高氧暴露后活動(dòng)明顯減少，精神狀態(tài)差，出現(xiàn)爬行姿勢(shì)不穩(wěn)、發(fā)育遲緩和驚厥等腦神經(jīng)系統(tǒng)損害表現(xiàn)，這與新生兒腦組織損傷后的臨床癥狀較相似，考慮原因?yàn)樾律笫箝L時(shí)間暴露于高氧環(huán)境中，導(dǎo)致神經(jīng)連接的密度、神經(jīng)細(xì)胞的活性降低及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)水平降低，同時(shí)促炎癥因子的釋放增加，加快神經(jīng)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，毛細(xì)血管數(shù)量減少，進(jìn)而破壞腦組織血液循環(huán)及供應(yīng)，從而出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常的表現(xiàn)，這與Bender等[13]報(bào)道的結(jié)果一致。檢測(cè)2組新生大鼠體質(zhì)量的結(jié)果顯示：高氧模型組大鼠體質(zhì)量的增長明顯低于對(duì)照組，提示高氧誘導(dǎo)可影響新生大鼠的新陳代謝，從而減慢各組織器官的生長發(fā)育情況，與文獻(xiàn)[3，7]報(bào)道相符。

表2 Western blotting法檢測(cè)2組大鼠腦組織中NPR-A和NPR-B表達(dá)水平

GroupNPR-A level(t/d) 137NPR-B level137Control0.740±0.0010.750±0.0060.840±0.0050.740±0.0020.750±0.0020.810±0.011Hyperoxia model0.880±0.048*1.030±0.007*1.160±0.008*0.790±0.019*0.790±0.0120.850±0.010

*P<0.05 compared with control group.

表3 ELISA法檢測(cè)2組大鼠腦組織中cGMP水平

CroupcGMP level(t/d) 137Control0.330±0.0160.360±0.0090.370±0.008Hyperoxia model0.390±0.011*0.430±0.018*0.460±0.006*

*P<0.05 compared with control group.

在新生兒大腦發(fā)育成熟的過程中，長期處于高氧環(huán)境可能使神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能受到損害，遠(yuǎn)期認(rèn)知功能也會(huì)產(chǎn)生一定的缺陷，但其發(fā)生機(jī)制是否與腦組織海馬區(qū)有關(guān)聯(lián)尚未明確[14]。文獻(xiàn)[15]報(bào)道：高氧暴露后引起的遠(yuǎn)期遲發(fā)性認(rèn)知、學(xué)習(xí)與記憶功能障礙可伴隨患兒持續(xù)至成年，但腦組織的損害不隨著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育而得到恢復(fù)，相關(guān)認(rèn)知功能的改變可能與海馬區(qū)域神經(jīng)通路有關(guān)。本研究中高氧模型組高氧暴露3 d的新生大鼠腦組織病理切片顯示：大鼠海馬椎體細(xì)胞體積縮小，排列稀疏；高氧暴露7 d時(shí)出現(xiàn)深染皺縮，細(xì)胞與周圍分界不清，呈現(xiàn)明顯病理損傷變化，提示高氧誘發(fā)的腦細(xì)胞損傷于高氧暴露后立即發(fā)生，隨著高氧暴露時(shí)間的延長(高氧暴露7 d時(shí))，腦損傷程度加重，大腦組織病理改變最為典型，臨床上這一階段正是新生兒腦組織神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育最快、同時(shí)也是最易受損的時(shí)期，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。另外高氧模型組新生大鼠腦組織電鏡下超微結(jié)構(gòu)的改變與Serdar等[17]報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)本研究已成功建立高氧腦損傷動(dòng)物模型。

NPs通過與其特異性受體NPRs結(jié)合而產(chǎn)生相應(yīng)的生理作用，包括排鈉利尿、擴(kuò)張血管、通過抑制RAAS系統(tǒng)和SNS系統(tǒng)進(jìn)而起到降壓作用等[18]，可緩解新生大鼠腦組織處于代償性缺氧缺血的狀態(tài)，改善腦水腫及腦血流不足的影響。研究[16，19]表明：人類和大鼠的NPR-A和NPR-B高表達(dá)于垂體、小腦、腎臟及心臟內(nèi)皮細(xì)胞，在腦組織中，嗅球僧帽細(xì)胞層、內(nèi)側(cè)韁核、穹隆下器官和后斑狀等區(qū)域皆有表達(dá)，在下丘腦和腦垂體的整個(gè)神經(jīng)葉中表達(dá)尤為明顯。NPR-A和NPR-B以單體-二聚體動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)存在，參與cGMP的合成，調(diào)節(jié)cGMP依賴蛋白的活性。cGMP作為胞內(nèi)特異性第二信使，激活并調(diào)節(jié)特定的依賴蛋白，參與神經(jīng)元間信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)NPs在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)。Domek等[20]研究顯示：cGMP在血小板聚集、松弛平滑肌和免疫調(diào)節(jié)中扮演重要角色，cGMP參與大腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育及生長過程，cGMP通過PKG和API轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)影響腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)和細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)中高氧暴露1、3和7 d時(shí)，新生大鼠腦組織中NPR-A及cGMP水平升高，而NPR-B水平升高程度小，考慮造成上述結(jié)果的原因可能與NPR-B蛋白基因調(diào)控系統(tǒng)中存在具有負(fù)反饋?zhàn)饔玫腸GMP反應(yīng)元件有關(guān)，其抑制了NPR-B蛋白的表達(dá)，與Farrow等[21]和劉瑤等[22]的研究結(jié)果一致，但其基因調(diào)控系統(tǒng)研究較少，仍有待于今后的進(jìn)一步探討。

綜上所述，高氧誘導(dǎo)下新生大鼠腦組織中NPR-A和cGMP水平升高，NRP-cGMP信號(hào)通路參與了高氧誘導(dǎo)腦損傷的發(fā)生。

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