催化H2O2氧化吖啶黃固體基質(zhì)室溫磷光法測(cè)定痕量秋水仙堿

孫莉娜，林常青,鄭志勇

(漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，福建，漳州 363000)

秋水仙堿(Colchicine，COL)不僅能用于治療痛風(fēng)及某些惡性腫瘤[1]，而且可預(yù)防與治療家族性地中海熱、腎臟、某些皮膚病及纖維化性疾病等[2]，顯示了較好的應(yīng)用前景。醫(yī)學(xué)報(bào)告顯示，對(duì)于成年人來(lái)說(shuō)，超過(guò)0.8 mg/kg的COL通常是致命的，研究報(bào)告口服藥物秋水仙堿最低的致命劑量是 7～26 mg[3-4]。顯然，COL與人體疾病密切相關(guān)，在臨床上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)，COL的測(cè)定有熒光法（檢出限(LD) 是[5]、HPLC 法[7]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)（LD 為5.0×10–11g·mL–1）[8]、伏安法[9]和薄層色譜法[10]等。然而，這些檢測(cè)方法中有的需要使用有毒有害的有機(jī)溶劑，有的由于設(shè)備昂貴，且操作繁瑣、分析成本較高而不利于推廣應(yīng)用[11]。如：HPLC/MS、HPLC需用有毒有害的有機(jī)溶劑萃取，操作繁瑣；伏安法、薄層色譜法與熒光法等的LD高，靈敏度低，在藥代動(dòng)力學(xué)研究中難以滿足對(duì)COL檢測(cè)的需要[8]；雖然 UPLC-MS/MS靈敏度高，但使用的儀器昂貴，分析成本高，應(yīng)用范圍有限。因此，探索一種高靈敏度、簡(jiǎn)易、快速、低成本的檢測(cè) COL新方法是極其有意義和價(jià)值的。由于固體基質(zhì)室溫磷光法（SS-RTP）比常見(jiàn)的熒光或磷光檢測(cè)手段更具有Stokes位移大、容易減少或消除本底熒光和散射干擾、發(fā)光壽命長(zhǎng)、檢測(cè)的選擇性更好等優(yōu)點(diǎn)，人們開(kāi)發(fā)了一系列的SS-RTP用于有機(jī)分子[12-14]、生物活性物質(zhì)[15-20]和有毒離子[21-22]等檢測(cè)，顯示了SS-RTP的潛在應(yīng)用前景。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，以 Pb2+為微擾劑時(shí)，吖啶黃（AY）在聚酰胺素膜(PAM)固體基質(zhì)上發(fā)射強(qiáng)而穩(wěn)定的室溫磷光信號(hào)（RTP）信號(hào)。在100℃反應(yīng)10 min條件下，COL可催化H2O2氧化AY的反應(yīng)，導(dǎo)致AY的RTP信號(hào)猝滅，且ΔIp值與COL含量呈線性關(guān)系，據(jù)此提出了催化SS-RTP法測(cè)定痕量COL的新方法。該方法的LD為0.037 fg·spot–1（樣品量為 0.40 μL/斑，對(duì)應(yīng)濃度為 9.3×10–14g·mL–1)， 比已報(bào)道的方法的檢出限（5.0×10–11g·mL–1）[8]低，這種靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性與選擇性好的SS-RTP鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，更適用于人血清中痕量秋水仙堿的分析。這種新方法的建立和應(yīng)用的研究，將有利于推動(dòng)COL檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LS-55型熒光分光光度計(jì)（Perkin Elmer公司），其儀器參數(shù)分別為：延遲時(shí)間0.1 ms，門控時(shí)間2.0 ms，循環(huán)時(shí)間20 ms，積分值1，激發(fā)狹縫10 nm，發(fā)射狹縫10 nm，掃描速度 1500 nm/min；固體前表面處理器（Perkin Elmer公司）；0.50 μL平頭微量注射器（上海醫(yī)用激光儀器廠）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

COL 工作液（先配成 10.0 μg·mL–1COL 的儲(chǔ)備液，臨用時(shí)逐級(jí)稀釋成 1.0 ng·mL–1、100.0 pg·mL–1和 10.0 pg·mL–1的 COL 溶液作為工作液）、1.0×10–4mol·L–1吖啶黃（AY）、2% (w/v) H2O2溶液、1.00 mol·L–1Pb2+溶液、三次石英亞沸蒸餾水。其中除 COL試劑為基準(zhǔn)試劑以外，其它試劑均為分析純。

定量濾紙（購(gòu)買杭州新華紙業(yè)有限公司）。聚酰胺膜(PAM)、硝酸纖維素膜（NCM）、醋酸纖維素膜（ACM）（均購(gòu)買路橋四甲生化塑料廠）。濾紙均先剪切成Ф = 1.5 cm圓片，壓痕（Ф = 4.0 mm），以備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

往25 mL比色管中加入適量COL、1.00 mLAY、4.00 mLH2O2，用蒸餾水定容，搖勻。于100 ℃下反應(yīng)10 min，流水冷卻5 min。將PAM放入1.00 mol·L–1Pb2+溶液中浸泡10 s后，在（90 ± 1）℃溫度下干燥2 min，再用0.50 μL規(guī)格的平頭微量注射器懸空點(diǎn)樣 0.40 μL，繼續(xù)在（90 ± 1）℃溫度下干燥 2 min，同時(shí)作試劑空白試驗(yàn)。在442 nm和507 nm處測(cè)定試劑空白(無(wú)秋水仙堿時(shí))的磷光信號(hào)與催化反應(yīng)試液的磷光信號(hào)Ip值 ，求出。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷光光譜

掃描COL-H2O2-AY體系磷光光譜（圖1）可知，用PAM作固體基質(zhì)，且在Pb2+的微擾下，AY會(huì)發(fā)射出強(qiáng)而穩(wěn)定的RTP信號(hào)（= 471.2/644.9 nm，Ip = 182.5，曲線1.1’）；當(dāng)2存在時(shí)，AY的RTP發(fā)生猝滅（= 71.5/645.3 nm，Ip = 171.6，曲線2.2’）；往體系中添加1000.0 pg COL溶液時(shí)，AY的RTP發(fā)生劇烈猝滅（λex/λem = 471.0/643.2 nm，Ip = 55.0，曲線 4.4’），其= 116.6，比非催化反應(yīng)體系的(10.9)大10.7倍，且與COL的含量存在著線性關(guān)系，為催化SSRTP測(cè)定COL含量提供了可能性。

圖1 COL -H2O2-AY 磷光光譜Fig.1 COL -H2O2-AY phosphorescence spectrum

2.2 表觀活化能(Ea)和速率常數(shù)(k)的測(cè)定

為了證明COL催化H2O2氧化AY的反應(yīng)可能，在最佳條件下考察了催化反應(yīng)的表觀活化能(Ea)和速率常數(shù)(k)。針對(duì) 4.8 fg·spot–1的 COL 溶液，進(jìn)行反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系ΔIp值的影響情況的探討，結(jié)果顯示：當(dāng)t = 10 min時(shí)，反應(yīng)溫度在60～100(℃) 范圍內(nèi)與–成正比，其回歸方程為=1.819×(1/T)×1000 –3.903 ， r =0.9966。當(dāng)T = 100°C時(shí)ΔIp最大，且表觀活化能E= 40.53 kJ ·mol–1；當(dāng) T =100℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間在 4～10（min）范圍內(nèi)能與成線性關(guān)系，且呈一級(jí)反應(yīng)關(guān)系，該回歸方程為 ln= –0.0732 +0.0306 t (min)，r = 0.9975。其中 10 min時(shí)最大，此時(shí)速率常數(shù) k = 3.97×10–4s–1，這些都說(shuō)明了 COL對(duì)氧化AY是有催化效應(yīng)。

2.3 測(cè)定條件的選擇

對(duì)體系中 4.8 fg·spot–1的 COL 溶液，分別探討各種試劑的濃度與用量、氧化劑、固體基質(zhì)、離子微擾劑、反應(yīng)酸度、反應(yīng)溫度和時(shí)間、通或不通干燥的 N2和放置時(shí)間等條件對(duì)體系 ΔIp的影響，結(jié)果如圖2～12所示。

圖2 AY濃度對(duì)ΔIp的影響Fig.2 The influence of AY concentration on ΔIp

圖3 AY用量對(duì)ΔIp的影響Fig.3 The influence of AY amount on Δip

圖4 H2O2濃度對(duì)ΔIp的影響Fig.4 The influence of H2O2 concentration on Δip

圖5 H2O2用量對(duì)ΔIp的影響Fig.5 The influence of H2O2 amount on ΔIp

圖6 固體基質(zhì)對(duì)ΔIp的影響Fig.6 The influence of Solid substrate on ΔIp

圖7 重離子對(duì)ΔIp的影響Fig.7 The influence of Heavy ion on ΔIp

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)ΔIp的影響Fig.8 The influence of reaction time on ΔIp

圖9 反應(yīng)溫度對(duì)ΔIp的影響Fig.9 The influence of reaction temperature on ΔIp

圖10 pH值對(duì)ΔIp的影響Fig.10 The influence of pH value on ΔIp

圖11 靜置時(shí)間對(duì)ΔIp的影響Fig.11 The influence of Incubation time on ΔIp

圖12 氧化劑對(duì)體系ΔIp的影響Fig.12 The influence of Oxidant on ΔIp

圖13 工作曲線的回歸方程Fig.13 The regression equation of the working curve

由圖2～12得出以下規(guī)律：

(1) 隨著 AY濃度和用量的增加，體系的值逐漸增大，當(dāng) AY 為 1.0 mL1.0×10–4mol–1時(shí)體系ΔIp值達(dá)到最大值。

(2) 雖然、、、、作為氧化劑時(shí)體系值較高，但以的最大，可能是的氧化能力最大。隨著濃度和用量的增加，體系的值逐漸增大。當(dāng)為4.0 mL2.0 %時(shí)，體系值達(dá)到最大值；當(dāng)超過(guò)4.0 mL2.0 %時(shí)體系的值幾乎不變。

(3) 在研究所考察的幾種固體基質(zhì)中，相對(duì)于濾紙、NCM和ACM，PAM發(fā)射磷光最強(qiáng)?？赡苁侵卦尤芤涸赑AM擴(kuò)散較慢，干燥時(shí)能迅速擴(kuò)散的緣故[25]。

(4) 雖然、、作為離子微擾劑時(shí)體系ΔIp值較高，但以的最大，可能是由于是重金屬離子，其重原子效應(yīng)很大程度提高了發(fā)光分子從S1態(tài)T1態(tài)的躍遷幾率，才使體系的值發(fā)生劇烈增強(qiáng)。研究表明：隨著濃度的增加，體系值增大；濃度為 1.00 mol時(shí)，體系值達(dá)到最大；濃度大于 1.00 mol時(shí)，體系值反而減少?？赡苁沁m度的重原子效應(yīng)能增加 AY從單線態(tài)向三線態(tài)躍遷幾率而使磷光增強(qiáng)，而過(guò)度的重原子效應(yīng)使磷光增強(qiáng)猝滅的緣故[22]。

(5) 當(dāng)pH在3.30～7.00范圍內(nèi)，隨著pH的增加體系的值線性增大；當(dāng)pH在7.00～9.60范圍內(nèi)，體系最大且穩(wěn)定。可能是在此pH值范圍內(nèi)COL的催化反應(yīng)速率最大。

(6) 隨著反應(yīng)溫度與時(shí)間的增加，體系值逐漸增大，可能是COL的催化反應(yīng)能力逐漸增大。當(dāng)反應(yīng)溫度與時(shí)間分別為100 ℃、10 min時(shí)，體系值最大，顯然，此時(shí)COL的催化反應(yīng)能力最強(qiáng)。

(7) 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在通入 3～25 min干燥 N2的條件下，體系是穩(wěn)定的，可能是氧氣及濕度的影響被消除的緣故。然而，不通干燥 N2時(shí)，隨著時(shí)間的增加，體系ΔIp值逐漸減小，表明了氧氣及濕度可導(dǎo)致RTP猝滅，故選擇通干燥N2時(shí)間為6 min最佳。

(8) RTP發(fā)射的穩(wěn)定性是實(shí)現(xiàn)催化SS-RTP測(cè)定痕量COL的關(guān)鍵。在最佳條件下，放置時(shí)間在40 min內(nèi)體系值幾乎不變，重現(xiàn)性好。當(dāng)放置時(shí)間超過(guò)40 min，體系的值逐漸減少，這可能與放置過(guò)程AY被潮解有關(guān)。

結(jié)果表明：當(dāng)用 1.00 mL1.0× 10–4mol·L–1AY 和4.00 mL 2.0%為氧化劑）、PAM為固體基質(zhì)、為離子微擾劑、反應(yīng)溫度為100 ℃和反應(yīng)時(shí)間為10 min、反應(yīng)pH為7.00、通干燥的N2時(shí)間為6 min、靜置時(shí)間為40 min時(shí)，體系的值最大且穩(wěn)定。此時(shí)體系的pH = 7.00。

2.4 工作曲線，線性范圍，精密度與檢出限

在最佳條件下，體系的與COL濃度含量呈線性關(guān)系（圖2），此研究方法的工作曲線的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、RSD%（分別對(duì) 0.16(fg·spot–1) 和16.0 ()的COL溶液進(jìn)行7次平行測(cè)定試驗(yàn)，并計(jì)算其 RSD%）、LOD（對(duì)試劑空白進(jìn)行11次的平行測(cè)定，求得Ip平均值為171.6，以3Sb/k計(jì)算，Sb = 0.083）、limit of quantification(LOQ)(以10Sb/k計(jì)算)等與文獻(xiàn)[5,8]方法比較于表1。

表1 幾種測(cè)定COL的方法比較Table 1 Several methods for determining COL are compared

本方法的g·mL–1，按計(jì)算，Sb = 0.083，n=11)比文獻(xiàn)[8]低，展現(xiàn)高的靈敏度。可能的原因：一是 COL催化反應(yīng)對(duì)測(cè)量信號(hào)的放大效應(yīng)；二是重原子的重原子微擾效應(yīng)，提高了AY分子往三重態(tài)躍遷的幾率，使體系的值劇烈變大。本方法不僅為超痕量COL的檢測(cè)提供了新技術(shù)，而且顯示了催化反應(yīng)對(duì)測(cè)量信號(hào)的放大效應(yīng)是進(jìn)一步提高SS-RTP靈敏度的一種有效途徑。

2.5 共存離子的影響

用本法分別測(cè)定12.0 pg·mL–1COL、12.0 pg·mL–1COL + X ng·mL–1共存離子（物），當(dāng)相對(duì)誤差為±5℅時(shí)，共存離子（物）的允許濃度與文獻(xiàn)、COL=399 ng=0.4 pgCOL[8])比較于表 2。

表2 共存離子（物）的影響Table 2 The effects of coexisting ions (objects)

由表2可知，本方法比文獻(xiàn)[8]方法的共存離子（物）允許存在濃度更高，選擇性更好，體現(xiàn)了本方法的研究?jī)r(jià)值。

2.6 樣品分析

6名健康志愿者于給藥前12 h，進(jìn)清淡晚餐后，禁食過(guò)夜，于次日早晨空腹服用秋水仙堿片2片(1 mg)，用溫開(kāi)水200 mL送服。參照文獻(xiàn)[8]方法，兩周后分別自上肢靜脈取血液5.00 mL，置肝素試管中，以3000 rpm的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上層人血清水定容至50 mL，－40°C保存?zhèn)溆茫y(cè)試。取1.00 mL試液，按上述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定 COL含量，同步做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)再與UPLC-MS/MS[8]進(jìn)行比較，結(jié)果列于表3。本法與UPLC-MS/MS測(cè)定秋水仙堿含量的的顯著性差異分析列于表4。

表3 人血清中秋水仙堿含量的分析結(jié)果Table 3 The analysis results of the content of narcissus in human serum

表4 測(cè)定結(jié)果的顯著性分析Table 4 A significant analysis of the results

由表3和表4可見(jiàn)，本方法用于人血清中COL含量的測(cè)定，結(jié)果與 UPLC-MS/MS相吻合，回收率為96.7%～98.6%，RSD為2.5%～4.3%，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。此外，人血清樣品的F值分別為 1.4、3.3、2.3、1.4、4.7和 2.1，表明 S1與 S2不存在顯著性差異；對(duì)應(yīng)的t值分別為 1.3、1.7、1.7、1.5、1.1和1.7，表明與不存在顯著性差異。因此，所設(shè)計(jì)的SS-RTP是靈敏的、準(zhǔn)確的，適用于人血清中COL的測(cè)定。

3 小結(jié)

本研究考察了催化SS-RTP的靈敏度、選擇性和用于測(cè)定痕量 COL的新方法的可行性，同時(shí)，探討了催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。新方法靈敏、簡(jiǎn)便、快速、選擇性好、準(zhǔn)確度高，用于人體血清中痕量COL的測(cè)定，結(jié)果與UPLC-MS/MS相吻合。本研究推動(dòng)了COL檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展。

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